基于生物信息學分析構建卵巢癌預后風險預測模型

熊廷川，張 園，朱長軍

（1.新疆醫科大學第三臨床醫學院（附屬腫瘤醫院）婦外三科，烏魯木齊830011；2.新疆醫科大學第三臨床醫學院（附屬腫瘤醫院）腫瘤防治研究所，烏魯木齊830011；3.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦科惡性腫瘤患者的主要死亡原因之一，可能影響所有年齡段的女性[1].根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥相關數據，2020年，全球女性卵巢癌新發病例31萬，死亡病例21萬，發病率和死亡率均位居女性常見癌癥第8位[2].雖然近幾年OC在診斷水平和治療技術方面均取得了不斷進步，但由于OC早期通常無癥狀，大多數患者被診斷時已屬于晚期，其5年生存率低于45%[1，3-4].OC具有異質性，不同患者在接受化學免疫療法或手術療法后，預后和生存時間可能存在較大差異[5-6].因此，基于個體的遺傳組成來準確預測疾病風險對于OC患者有效預防和個性化治療至關重要.Cox比例風險模型是常用的對于腫瘤和其他慢性病進行預后分析的風險模型，該模型可用于分析患者的總生存期及影響生存結果的危險因素[7]，已被廣泛應用于多種腫瘤的預后分析，可為臨床根據患者身體特征制定個體化治療方案提供指導[8-9].

本研究基于6個OC基因芯片，對OC樣本與正常樣本的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行篩選，通過單因素Cox回歸分析和LASSO分析構建OC風險模型，并驗證該模型的預測價值和準確性.以期通過該風險模型對OC患者的生存和預后進行預測，有針對性地為患者制定個體化治療方案，也可為OC患者的早期篩查提供依據，從而提高患者的生命質量.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人正常卵巢細胞IOSE-80與人OC細胞A2780、CAOV3，美國ATCC細胞庫；人OC細胞OVCAR-3和SK-OV-3，中國科學院細胞庫.

RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及SYBR green qRT-PCR試劑盒，日本Takara公司；RPMI 1640培養基及胎牛血清（FBS），美國Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

所有細胞均采用含有100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10%FBS的RPMI-1640培養基，于37℃、5%CO2環境下培養.

1.2.2 RNA提取及qRT-PCR分析

采用RNA提取試劑盒提取對數生長期細胞的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA.然后按SYBR green qRT-PCR試劑盒說明書檢測關鍵風險因子的mRNA水平.采用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達量.

1.2.3 芯片數據選擇與分析

從GEO數據庫中下載6個OC相關基因芯片數據集：GSE69428、GSE10971、GSE54388、GSE14407、GSE4122、GSE12470.分別從GPL570平臺獲取GSE69428、GSE10971、GSE54388、GSE14407注 釋 信息，GPL201平臺獲取GSE4122注釋信息，GPL887平臺獲取GSE12470注釋信息.利用R語言包以及limma工具包對6個芯片數據集中的共同差異基因進行分析，|logFC|>1，P<0.05.

1.2.4 DEGs的GO和KEGG分析

通過Metascape在線分析工具（http://metascape.org）對篩選得到的99個DEGs進行GO（gene ontology）功能分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，設置P<0.05.

1.2.5 單因素和多因素Cox分析

通過單因素及多因素Cox回歸分析篩選DEGs中與OC患者生存相關的風險因子，進一步采用LASSO算法基于風險因子構建與OC患者生存相關的風險模型（risk score，RS），計算公式如下：

式中：Exp為Cox回歸模型中篩選出的風險因子在樣本中的表達量；β為Cox模型中所選擇的各個風險因子Cox回歸分析的系數.以RS的中位值為分界值，將數據集中的OC患者分為高風險和低風險組.采用survival工具包繪制Kaplan-Meier（KM）生存曲線，對高、低風險組中OC患者的總生存率進行評價.P<0.05視為差異具有統計學意義.

1.2.6 OC風險模型預測能力分析

運用R軟件中的survival ROC工具包繪制時間依賴的受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），并依據ROC曲線下的面積（area under the ROC curve，AUC）評價該Cox風險評估模型對OC患者3-、5-、8-、9-、10 a的總體生存期的預測能力.采用單因素、多因素Cox回歸分析該模型風險得分在OC患者總體生存期、癌癥狀態、預后結局預測及臨床早篩中的作用.P<0.05視為差異具有統計學意義.

1.2.7 TCGA數據庫數據收集

以TCGA數據集中提供的OC患者相關資料為基礎，分析OC風險模型預測能力.TCGA_OV數據集中包含378個OC臨床參數和生存資料的病例，以RS的中位值為分界值，高風險組和低風險組分別包含189例樣本.

2 結果與分析

2.1 OC芯片DEGs篩選

從GEO數據庫中選擇了6個OC相關基因芯片：GSE69428、GSE10971、GSE54388、GSE14407、GSE4122、GSE12470，各芯片數據包含的樣本量如表1所示.最終在6個芯片中獲得了99個共失調的DEGs，其中包含24個下調基因和75個上調基因.

表1 芯片信息Tab.1 Chip information

2.2 DEGs的GO功能富集和KEGG通路分析

使用Metascape在線分析，對99個DEGs進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，結果如圖1所示.DEGs主要與細胞周期過程的調節、生長調控、代謝調控、細胞成分組織的負調控、表皮細胞分化、免疫系統細胞因子信號轉導、胞質分裂等生物活動顯著相關.DEGs主要富集在細胞周期、藥物代謝、癌癥中的轉錄失調、癌癥相關通路以及p53、HIF-1等信號通路.

圖1 DEGs的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析Fig.1 Analyses of GO function enrichment and KEGG pathway enrichment of DEGs

2.3 OC患者預后風險模型構建

基于前期OC基因芯片分析結果，對篩選出的DEGs進行單因素Cox回歸分析，結果發現DEGs中有9個因子與TCGA-OV中OC患者的總體生存期顯著相關（P<0.05），如表2所示.進一步通過LASSO算法對這9個DEGs進行分析，最終獲得了由5個DEGs組成的風險模型，如圖2所示.

表2 單因素Cox回歸分析Tab.2 Univariate Cox analysis

模型中5個風險因子為EPS8、ARL4C、HMGB3、JUP和USP18，EPS8在6個OC相關芯片中均下調表達，其余4個因子在OC相關芯片中上調表達，如表3和圖3所示.

圖3 風險因子在不同數據集中的表達水平分析Fig.3 Expression of risk factors in different datasets

表3 風險因子信息Tab.3 Information of risk factors

圖2基于LASSO方法構建OC風險模型Fig.2 Construction of OC risk model based on LASSO method

2.4 Kaplan-Meier生存曲線和ROC曲線的繪制

基于風險得分中位值，將每組數據集中的OC患者分為高風險組和低風險組，利用R語言繪制Kaplan-Meier（KM）生存曲線，分析OC患者總生存期、風險評分的分布及患者的生存現狀.分析結果顯示，TCGAOV中低風險組患者預后顯著優于高風險組（P<0.05），而在GEO獨立數據集GSE26712、GSE23554中也得到了相同的結果，如圖4所示.進一步通過ROC分析，發現該模型風險得分對于卵巢癌患者3-、5-、8-、9-、10 a的總體生存期具有相當高的預測能力，如圖5所示.提示該模型可用于OC患者的預后情況預測，可能具有重要的臨床價值.

圖4 KM生存曲線分析不同數據集中OC患者總生存期、風險評分分布與患者的生存現狀Fig.4 KM survival curve analysis for overall survival of OC patients in different datasets and the analysis of the distribution of risk scores and the survival status of OC patients

圖5 ROC曲線評價OC風險模型對不同數據集中患者生存期的預測能力Fig.5 ROC curve to evaluate the predictive ability of the OC risk model for patient survival in different datasets

2.5 Cox回歸模型預測價值驗證

進一步通過單因素、多因素Cox回歸分析該風險模型預測價值，結果顯示，風險得分與OC患者的總體生存期顯著相關，如表4和圖6所示.風險得分與TCGA-OV中OC患者的癌癥狀態、預后結局顯著相關，即有癌癥進展或者死亡的患者風險得分均顯著較高，如圖7所示，說明該風險模型可用于臨床預測OC患者的生存和預后情況.此外，該模型風險得分還可以很好地區分OC與正常樣本，如圖8所示，這揭示了該模型可能對于OC臨床早期篩查有一定的輔助作用.

圖6 風險模型對OC患者總體生存期的預測能力Fig.6 Predictive ability of the risk model for the overall survival of OC patients

圖7 風險模型對OC患者癌癥狀態、預后結局的預測能力Fig.7 Predictive ability of the risk model for the cancer status and prognostic outcome of OC patients

圖8 風險模型區分不同數據集中OC與正常樣本Fig.8 Risk model can be used to distinguish OC from normal samples in different data sets

表4 單因素和多因素Cox回歸分析Tab.4 Univariate and multivariate Cox analyses

2.6 關鍵風險因子表達驗證

進一步采用qRT-PCR檢測組成風險模型的5個關鍵基因在人正常卵巢細胞IOSE-80和人OC細胞A2780、CAOV3、OVCAR-3和SK-OV-3中的表達水平，結果如圖9所示.與人正常卵巢細胞相比，風險因子EPS8在4種人OC細胞中均顯著下調表達（P<0.05），HMGB3、JUP、USP18和ARL4C在4種人OC細胞中均顯著高表達（P<0.05）.

圖9 qRT-PCR驗證關鍵風險因子在不同OC細胞中的表達水平Fig.9 Expression levels of key risk factors in different OC cells verified by qRT-PCR

3 討論與結論

OC是致命的婦科癌癥之一，盡管近幾年生物標志物發展迅速，但由于發病隱匿，目前尚無有效的OC早期檢查策略和治療方法，導致患者復發率高，生存率較低[10].據報道，早期發現可以使OC患者死亡率降低10%到30%[4].隨著基因檢測技術和生物信息學的不斷發展，惡性腫瘤預測風險模型的引入，有可能為OC的早期診斷、臨床治療和預后風險評估提供新的切入點和思路.Cox比例風險模型在醫學領域的應用越來越廣泛，基于此模型篩選慢性疾病或多種癌癥相關風險因素，預測患者治療效果及生存情況，有助于關注高風險患者群體，為精準醫療模式下個體化臨床治療方案的制定提供依據.如He等[11]通過多元Cox比例風險模型證實SNP rs3803662（TOX3/TNRC9）是河南漢族人群乳腺癌的獨立預后因素；Arends等[12]構建的下咽癌生存期臨床預測模型，可顯著識別臨床風險群體，從而提高生存期的個體化評估.

本研究對6個OC基因芯片中OC樣本與正常樣本的DEGs進行篩選，最終篩選到99個在6個芯片中共失調的DEGs.GO和KEGG分析結果顯示，這些基因主要與細胞周期過程調控、細胞成分組織的負調控、免疫系統細胞因子信號轉導、p53、HIF-1信號通路等顯著相關.這些結果與現有報道一致，如趨化因子IFNγ途徑基因在OC患者中缺失，并且與免疫評分低和不良預后顯著相關[13]；靶向HIF-1信號通路調控的腫瘤代謝能夠克服OC細胞對順鉑的耐藥性等[14].本研究進一步對篩選出的DEGs進行單因素、多因素Cox回歸分析及LASSO算法，構建了由EPS8、ARL4C、HMGB3、JUP和USP18組成的OC風險評估模型.生存分析結果顯示，高風險組患者和低風險組患者的總生存期和生存結局存在顯著差異.該模型對OC患者3-、5-、8-、9-、10 a的總體生存期預測能力較高，可用于臨床預測OC患者的預后情況.風險得分可顯著區分OC患者和正常樣本，提示該風險模型有助于提高OC早期篩查能力.

風險模型中的5個DEGs中，EPS8即表皮生長因子受體通路底物8（epidermal growth factor receptor pathway substrate 8）是一種新型的表皮生長因子受體（EGFR）激酶底物，參與了EGFR介導的與多種癌癥發生、增殖和轉移相關的信號通路[15].在OC中，EPS8能夠與ABI1和SOS1蛋白形成復合體，參與OC細胞侵襲和轉移[16-17].ADP-核糖基化樣因子4C（ADP-ribosylation factor-like 4C，ARL4C）是ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor，Arf）家族成員之一，ARL4C在成人組織中幾乎不表達，但在原發性肝細胞癌和結直腸癌[18]、膠質母細胞瘤[19]、胃癌[20]等中高表達.研究顯示，ARL4C在子宮內膜異位癥相關卵巢癌患者中上調表達，并與患者5 a生存期較差顯著相關[21]，有望成為卵巢癌預后的潛在預測指標.HMGB3即高遷移率族蛋白3（high mobility group-box 3），屬于高遷移率族蛋白家族（HMGB），在DNA修復、重組、轉錄和復制中起關鍵作用，可通過調節細胞周期參與乳腺癌[22]、非小細胞肺癌[23]等多種腫瘤進展.Mukherjee等[24]發現HMGB3在OC中上調表達，并且可以提高OC化療耐藥細胞對順鉑的敏感性，提示靶向HMGB3可能是克服OC化療耐藥的潛在治療策略.JUP為連接橋粒斑珠蛋白（junction plakoglobin），在上皮性卵巢癌患者靜脈血中高表達，并與腫瘤惡性進展相關[25].USP18為泛素特異性蛋白酶18（ubiquitin specific protease 18），是去泛素化酶亞家族成員之一，USP18不僅與增殖、分化、發育等生理過程相關，在包括傳染病、神經系統疾病和癌癥在內的多種疾病的發病機制中也有重要作用[26]，然而，它在OC中的作用仍有待探究.進一步采用qRTPCR驗證5個風險因子在人正常卵巢細胞和4種人OC細胞中的表達，結果顯示EPS8在4種人OC細胞中均顯著下調表達，HMGB3、JUP、USP18和ARL4C則在4種人OC細胞中均顯著高表達，與前期預測結果一致.

綜上，本研究通過對OC芯片中DEGs進行篩選，構建了由5個風險因子組成的OC風險預測模型，該模型可能用于篩選高風險患者群體，也可用于預測OC患者的生存和預后情況，因此，具有一定的臨床應用潛力.但該模型是否能夠作為預測OC患者預后和指導臨床實踐的有用工具，還需進一步驗證.