脆弱擬桿菌PSA對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的治療作用

甘伙燁 彭鐵立 覃喜香 楊榮嬌 周小俐

廣東省清遠市人民醫(yī)院 廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院 廣州醫(yī)科大學消化病研究所，廣東清遠 511500

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種結(jié)直腸慢性非特異性疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液血便，多呈反復(fù)發(fā)作。在國內(nèi)外，該病的發(fā)病率和患病率都呈上升趨勢，而在我國則更加明顯[1-5]。UC的病因和發(fā)病機制尚未明確，但目前認為腸道菌群失調(diào)是其發(fā)病的一個重要觸發(fā)點。臨床研究表明脆弱擬桿菌（bacteroides fragilis，B.fragilis）有改善腸道炎癥的作用，它表面多糖中的多糖A（PSA）是起益生作用的主要成分。目前對PSA在治療UC中的作用及相關(guān)機制還知之甚少。本實驗將采用葡聚糖硫酸鈉誘導的慢性UC小鼠模型，初步探討B(tài). fragilis PSA對UC的治療效果及可能機制，以期為臨床應(yīng)用B. fragilis尤其是其PSA成分治療UC提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性BALB/c小鼠24只，鼠齡6～8周齡，體重21～26 g，平均（23.2±1.0）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SYXK（粵）2019-0206。

1.2 儀器與試劑

葡聚糖硫酸酯鈉鹽（DSS）購自美國MP Biomedicals公司，批號為0216011080；糞便隱血檢測試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒購自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和干預(yù)方法 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、DSS組、DSS+PSA組，每組各8只。各組干預(yù)情況如下：正常對照組，該組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不進行任何處理。DSS組，參考Wirtz等[6]的造模方法，第一周期給予2%DSS溶液小鼠自由飲用7 d，然后給予小鼠自由飲用蒸餾水14 d；重復(fù)一周期后，再給予小鼠自由飲用2% DSS溶液7 d。DSS+PSA組，在給予DSS組處理基礎(chǔ)上，每天給予濃度為100 μg/ml的PSA液0.5 ml灌胃，最后在第51天予二氧化碳處死小鼠。

1.3.2 疾病活動度 從造模之日起，每天監(jiān)測小鼠體重，觀察小鼠活動、精神、飲食、大便性狀和便血情況，并計算小鼠的疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）以判斷造模情況及觀察療效。DAI為體重下降、大便性狀及便血情況評分的總和，評分標準如下[7]：體重下降≤1%、1%＜體重下降≤5%、5%＜體重下降≤10%、10%＜體重下降≤20%和體重下降＞20%分別計為0、1、2、3和4分；無便血、大便隱血（+）和肉眼血便分別計為0、2和4分；大便性狀正常、松散（呈糊狀或半成形大便，不黏附于肛門）和稀便（呈稀水樣便）分別計為0、2和4分；每只小鼠的DAI評分為3項的平均值。

1.3.3 結(jié)腸大體形態(tài)及組織病理學 觀察結(jié)腸大體形態(tài)，將小鼠結(jié)腸組織以10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋并制備4 μm切片，行HE染色，以盲法觀察，光鏡下觀察腸黏膜損傷情況，采用Shah等[8]標準對結(jié)腸組織的HE染色切片進行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colon mucosal damage index，CMDI）評估。

1.3.4 ELISA檢測 小鼠摘除眼球采血，4℃低溫高速離心機中2500 r/min離心20 min，收集上清液，用ELISA法測定血清核因子（NF）-κB水平，操作流程按照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示；兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析F檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠DAI、CMDI評分比較

正常對照組小鼠大便正常、體重增加、毛發(fā)有光澤、飲食、活動均正常。DSS組小鼠從第6天開始出現(xiàn)毛發(fā)無光澤、活動減少、稀便，大便帶血或血便等，造模成功。DSS+PSA組小鼠從第23天開始出現(xiàn)毛發(fā)無光澤、活動減少、稀便，大便帶血或血便等，各組無小鼠死亡。與正常對照組比較，DSS組、DSS+PSA組小鼠DAI評分均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.8602，P=0.0002）；DSS+PSA 組小鼠DAI評分較DSS組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.7277，P=0.0312）。與正常對照組比較，DSS組、DSS+PSA組小鼠CMDI評分均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.8126，P=0.0000）；DSS+PSA 組小鼠CMDI評分較DSS組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.1911，P=0.0081）。見表 1。

表1 各組小鼠DAI、CMDI評分比較（，分）

表1 各組小鼠DAI、CMDI評分比較（，分）

組別 n DAI評分（51 d） CMDI評分正常對照組 8 0.00±0.00 2.08±0.83 DSS組 8 2.50±0.75 17.65±3.02 DSS+PSA組 8 1.75±0.46 8.07±1.35 F值 12.8602 28.8126 P值 0.0002 0.0000

2.2 小鼠結(jié)腸大體形態(tài)

正常對照組小鼠結(jié)腸長度正常，無充血水腫和潰瘍形成；DSS+PSA組小鼠結(jié)腸長度稍縮短，局部充血，沿腸系膜剪開可見糜爛形成；DSS組小鼠結(jié)腸縮短、腸壁僵硬、充血，沿腸系膜剪開可見糜爛甚至潰瘍，程度較DSS+PSA組更嚴重，見圖1。

圖1 三組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)

2.3 小鼠結(jié)腸組織HE染色情況

HE染色結(jié)果顯示DSS+PSA組小鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，杯狀細胞減少，部分腺體結(jié)構(gòu)紊亂、排列不規(guī)則伴炎癥細胞浸潤；DSS組小鼠結(jié)腸黏膜上皮破壞更嚴重，可見隱窩結(jié)構(gòu)消失、潰瘍形成，大量炎癥細胞浸潤黏膜和黏膜下層，見圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色 （×200）

2.4 ELISA檢測各組小鼠血清NF-κB濃度

正常對照組、DSS組、DSS+PSA組小鼠血清NF-κB濃度分別為（76.5±9.6）ng/L、（142.0±17.6）ng/L、（107.0±15.6）ng/L。與正常對照組相比，DSS組、DSS+PSA組小鼠血清NF-κB濃度均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=32.343，P=0.0000）；DSS+PSA組小鼠血清NF-κB濃度較DSS組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.182，P=0.0012）。

3 討論

UC是發(fā)生在結(jié)直腸黏膜及黏膜下層的慢性非特異炎性疾病，以腸道炎癥及黏膜損傷為主要病理表現(xiàn)[9-11]，目前認為其發(fā)病機制可能與腸道菌群失調(diào)、易感基因、環(huán)境因素及免疫系統(tǒng)異常的相互作用有關(guān)[12-14]。

正常情況下腸道菌群構(gòu)成一個相互制約、相互依存的微生態(tài)平衡系統(tǒng)，對人體的健康起到重要作用，一旦這種平衡被打破，則會引起腸道菌群失調(diào)，從而引發(fā)疾病或者加重病情。

人類腸道內(nèi)有超過1000種，約10萬億個細菌，占總數(shù)約1/4的擬桿菌是其中的優(yōu)勢菌群，B. fragilis作為擬桿菌的代表菌株，寄居于人結(jié)腸黏膜，B. fragilis則為一種條件致病菌。有研究報道稱，B. fragilis的表面多糖是發(fā)揮益生特性的主要成分，B. fragilis可通過多種方式發(fā)揮其益生特性，它可通過淀粉利用系統(tǒng)去分解食物多糖和機體黏蛋白多糖，占據(jù)不同的代謝位而定植于腸道[15]，還可以利用自身的共生菌定植因子影響其他菌群的定植，維持腸道菌群的平衡，而在給予自閉癥模型B. fragilis處理后發(fā)現(xiàn)其腸道內(nèi)的未分類擬桿菌和毛螺旋菌科的豐度顯著增多[16]。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種組織中，NF-κB在核內(nèi)與κB序列結(jié)合促進各種炎性細胞因子如TNF-α、IL-2、IL-10、IL-1β等基因轉(zhuǎn)錄，在免疫和炎癥反應(yīng)及一些疾病急性期反應(yīng)方面起重要作用，參與細胞凋亡等多種生理病理過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在UC中，NF-κB被誘導激活，調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)量，進而導致UC炎癥黏膜損傷[17-18]。

本研究顯示，利用2% DSS誘導的慢性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，小鼠自由飲用2% DSS一段時間后會出現(xiàn)毛發(fā)無光澤、活動減少、稀便，大便帶血或血便等現(xiàn)象，小鼠結(jié)腸出現(xiàn)明顯短縮，腸壁僵硬、充血，可形成糜爛甚至潰瘍，顯微鏡下可見其結(jié)腸黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，杯狀細胞減少，部分腺體結(jié)構(gòu)紊亂，隱窩結(jié)構(gòu)消失，大量炎癥細胞浸潤黏膜和黏膜下層，給予小鼠B. fragilis PSA可使其推遲出現(xiàn)毛發(fā)無光澤、活動減少、稀便，大便帶血或血便等現(xiàn)象，且前述結(jié)腸損傷可獲得明顯緩解。小鼠自由飲用2% DSS一段時間后血清NF-κB濃度可明顯升高，而給予小鼠B. fragilis PSA可明顯減輕其血清NF-κB濃度的升高。因此，B. fragilis PSA能明顯改善UC小鼠的精神狀態(tài)、DAI評分、CMDI評分、結(jié)腸大體形態(tài)及組織病理學損傷，抑制NF-κB的表達，從而發(fā)揮治療UC 的作用。