6S-5-甲基四氫葉酸鈣對小鼠免疫力的增強作用研究

薛 娟 馬文斌 涂 華 劉 康 成永之 連增林▲

1.北京金康和信藥業科技有限公司，北京 100176；2.連云港金康和信藥業有限公司，江蘇連云港 222000

補充葉酸（folic acid，FA）能夠降低神經管畸形及腦卒中的發病率，有助于多種疾病的治療[1-2]，葉酸還原酶將非活性的葉酸代謝形成的5-甲基四氫葉酸等活性葉酸激活，5-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸的關鍵代謝酶[3-4]，然而，有26.4%的中國人因為存在該酶的基因位點突變，不能將葉酸轉化為活性的5-甲基四氫葉酸，無法發揮其治療作用，有人群應用的局限性[5]。

6S-5-甲基四氫葉酸鈣（商品名：葉源酸?）是一種創新型5-甲基四氫葉酸的鈣鹽，它能夠克服葉酸還原酶點突變所致的葉酸活性轉化的限制，適用于各種人群。目前，該專利產品作為葉酸新來源已經被允許用于調制乳粉和固體飲料[6]。但是，至今國內外對其研究多集中在合成方法、含量檢測、穩定性等方面[7-8]，尚未對其功能展開深入研究，為探討其潛在的醫療保健價值，本研究探討6S-5-甲基四氫葉酸鈣對機體免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

6S-5-甲基四氫葉酸鈣[9]（連云港金康和信公司，批號 20141209，發明專利號：ZL201410280541.4）為類白色結晶粉末，實驗以飲用純凈水為溶媒，分別配制成低 0.8 mg/（kg·d）、中 1.7 mg/（kg·d）、高5.0 mg/（kg·d）三個劑量，分別相當于人推薦量的5、10、30倍；SPF級ICR小鼠購自上海西普爾-必凱公司[SCXK（滬）2013-0016]，雄性，體重16～20 g，動物質量合格證號為2008001646720，實驗前，動物在實驗室內適應性喂養4 d。

1.2 實驗方法

樣品液配制方法：取6S-5-甲基四氫葉酸鈣0.12 g，加溶媒至240 ml，溶解后混勻，得高劑量為0.5 mg/ml；取高劑量溶液 70 ml，加溶媒 140 ml，混勻后得中劑量為0.17 mg/ml；取中劑量溶液70 ml，加溶媒70 ml，混勻后得低劑量為0.08 mg/ml，按照小鼠1.0 ml/100g體重給藥。

按照體重將動物隨機分成陰性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別灌胃給予低0.8 mg/（kg·d）、中1.7 mg/（kg·d）、高5.0 mg/（kg·d）劑量的樣品液，陰性對照組灌胃給予同等容積的飲用純凈水。每日給藥1次，連續30～38 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 小鼠體重及臟器/體重比 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥，在第一次給樣品之前（始重）、給樣品的第15天（中重）、給樣品的第30天（終重），稱量小鼠的體重并記錄；實驗第37天，取胸腺和脾臟稱重，計算胸腺/體重比和脾臟/體重比值。

1.3.2 小鼠脾淋巴細胞增殖能力 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第36天，處死動物，參照瞿飄飄[10]的方法用刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導小鼠脾淋巴細胞轉化，MTT法檢測細胞增殖情況，在570 nm波長處測定吸光值（OD值），根據式（1）計算淋巴細胞的增殖能力。

1.3.3 小鼠遲發型超敏（delayed type hypersensitivity，DTH）反應 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第34天，腹腔注射0.2 ml 2%（v/v）壓積綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）懸液，免疫后的第 4 天，參照何曉波等[11]的方法皮下注射20%(v/v)SRBC，測量攻擊前后其足跖周長間的差值，以此來表示DTH程度。

1.3.4 小鼠抗體生成細胞溶血空斑數 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第31天，腹腔注射0.2 ml 2% （v/v）SRBC懸液進行免疫，4 d后處死動物，制備脾細胞懸液（5×106個/ml），參照李詠梅等[12]方法混合瓊脂糖培養基、10% SRBC（v/v）和脾細胞懸液，并傾倒在玻片上，加入稀釋后的補體溫育1 h，計數溶血的空斑數。

1.3.5 小鼠血清溶血素測定抗體積數 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第34天，腹腔注射0.2 ml 2%（v/v）（SRBC）懸液進行免疫，免疫5 d后，收集血清作倍比稀釋，參照趙珺彥等[13]的方法將血清置于微量血凝板，并與等量0.5% SRBC懸液混勻，37℃溫箱中孵育3 h，觀察并記錄血球凝集程度級數，根據式（2）計算出抗體積數。

式中：倍比稀釋的指數用1、2、3……n代表，凝集程度級數用S代表。

1.3.6 小鼠碳廓清實驗吞噬指數 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第38天，尾靜脈注入墨汁后立即計時，參照邱紅梅等[14]的方法在墨汁注入后的2、10 min眼眶取血，加入到2 ml 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波長處測定OD值，而后稱量肝重、脾重，根據式（3）（4）計算吞噬指數。

1.3.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞數 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第37天，向小鼠腹腔內注射1 ml 20%（v/v）雞紅細胞懸液，間隔30 min后處死，參照陳麗芳等[15]的方法取腹腔洗液滴加在載玻片上，37℃培養箱中孵育30 min，Giemsa染色后在油鏡下計數巨噬細胞，依照下式（5）計算吞噬百分率。

1.3.8 自然殺傷細胞（natural killer cells，NK cells）活性測定實驗 動物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續給藥至實驗第36天，處死動物，參照朱鴻哲[16]的方法制備靶細胞和脾細胞懸液(效應細胞)，按照效靶比50∶1加入96孔板，放置在37℃ 、5% CO2培養箱中培養4 h，每孔取上清液100 μl置于96孔板，同時，加入等量LDH基質液，反應7 min后，每孔加入30 μl 1 mol/L的鹽酸溶液，在490 nm處測OD值，并根據式（6）計算NK細胞的活性。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠體重及臟器/體重比

各劑量組小鼠體重隨著給藥時間延長而增加，與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；各劑量組小鼠的脾臟/體重比、胸腺/體重比均低于陰性對照組，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重及臟器/體重比值比較（）

表1 各組小鼠體重及臟器/體重比值比較（）

組別 n 始重（g） 中重（g） 終重（g） 胸腺/體重（mg/g） 脾臟/體重（mg/g）陰性對照組 10 18.8±0.4 26.4±0.9 37.2±1.0 1.58±0.22 4.56±0.91低劑量組 10 18.8±0.4 27.0±0.8 37.2±1.3 1.55±0.20 4.12±0.32中劑量組 10 18.8±0.5 26.1±1.1 36.9±1.0 1.52±0.16 4.04±0.40高劑量組 10 18.8±0.5 26.9±1.4 36.7±1.6 1.50±0.20 4.29±0.48 F值 0.090 1.893 0.675 0.327 1.592 P值 0.965 0.143 0.572 0.806 0.208

2.2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖能力和DTH反應程度比較

各劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖能力OD差值隨劑量升高而增加，中、高劑量組顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各劑量組小鼠左后足跖部周長差值均有所增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖能力和DTH反應程度比較（）

表2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖能力和DTH反應程度比較（）

注：與陰性對照組比較，**P＜0.01

陰性對照組 10 0.251±0.053 0.071±0.023低劑量組 10 0.247±0.042 0.095±0.046中劑量組 10 0.369±0.048** 0.093±0.019高劑量組 10 0.534±0.050** 0.105±0.042 F值 77.535 1.740 P值 0.000 0.176組別 n 淋巴細胞增殖能力 DTH程度

2.3 各組小鼠抗體生成細胞溶血空斑數和血清溶血素抗體積數比較

各劑量組溶血空斑數和血清溶血素抗體積數隨劑量升高而增加，中、高劑量組顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠抗體生成細胞溶血空斑數和血清溶血素抗體積數（）

表3 各組小鼠抗體生成細胞溶血空斑數和血清溶血素抗體積數（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

陰性對照組 10 28.3±3.2 54.3±8.8低劑量組 10 29.6±3.5 64.3±19.3中劑量組 10 37.0±2.8** 86.6±29.8*高劑量組 10 41.2±2.1** 91.0±29.7**F值 43.553 5.574 P值 0.000 0.003組別 n 溶血空斑數（個）/全脾細胞數 抗體積數

2.4 各組小鼠碳廓清實驗吞噬指數比較

各劑量組吞噬指數隨劑量升高而增加，顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠碳廓清實驗吞噬指數比較（）

表4 各組小鼠碳廓清實驗吞噬指數比較（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 吞噬指數陰性對照組 10 5.79±0.68低劑量組 10 6.63±0.71*中劑量組 10 6.88±0.91**高劑量組 10 7.10±0.74**F值 5.553 P值 0.003

2.5 各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞指數比較

各劑量組的吞噬百分率（P）和吞噬指數X數值均增加，中、高劑量組顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞指數（）

表5 各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞指數（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05

組別 n 吞噬百分率（%） 吞噬指數X陰性對照組 10 35.5±1.8 0.638±0.019低劑量組 10 38.7±3.3 0.671±0.034中劑量組 10 40.0±3.2* 0.684±0.033*高劑量組 10 39.6±4.9* 0.680±0.050*F值 3.398 3.407 P值 0.028 0.028

2.6 各組小鼠NK cells活性比較

各劑量組小鼠NK cells活性均增加，顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠NK cells活性比較（）

表6 各組小鼠NK cells活性比較（）

注：與陰性對照組比較，**P＜0.01

組別指數X陰性對照組 10 3.44±2.72 0.171±0.082低劑量組 10 14.35±4.59** 0.384±0.067**中劑量組 10 22.03±5.80** 0.486±0.067**高劑量組 10 20.97±4.03** 0.474±0.048**F值 37.229 47.167 P值 0.000 0.000

3 討論

本研究中小鼠灌胃給予6S-5-甲基四氫葉酸鈣后，三個劑量組小鼠體重變化差別不大，脾臟/體重比、胸腺/體重比平均值低于陰性對照組，小鼠遲發型超敏反應增強，差異無統計學意義（P＞0.05），提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣未顯著改變小鼠體重、臟器重量以及DTH反應；低、中、高劑量組小鼠碳廓清功能、NK細胞活性均顯著增加（P＜0.05），提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣能顯著提高小鼠單核巨噬細胞吞噬能力和NK細胞殺傷靶細胞的能力；中、高劑量組小鼠淋巴細胞增殖能力、溶血空斑數、抗體積數和巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力均顯著提高（P＜0.05）。實驗結果表明，6S-5-甲基四氫葉酸鈣具有增強小鼠免疫力的作用。

免疫系統是機體防御外來抗原物質的屏障，在機體免疫應答中，通常由非特異性免疫和特異性免疫反應共同發揮作用。免疫能力的強弱與機體抗病能力和疾病預后具有密切關系。巨噬細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞均為發揮免疫功能最重要的免疫指標，考察其變化與否是直接評價人體免疫能力以及各種藥物對機體免疫調節作用的重要手段。

本研究采用小鼠和細胞實驗研究了6S-5-甲基四氫葉酸鈣的免疫調節作用。實驗結果顯示，6S-5-甲基四氫葉酸鈣能夠顯著增加巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬指數，可能是由于其刺激吞噬細胞數量增加所致，為非特異性免疫增強的表現形式；NK細胞是免疫系統中一類特殊的淋巴細胞，它可以被激活以介導細胞毒性活性，并產生高水平的細胞因子和趨化因子，參與非特異性的抗病毒防御機制。而且，NK細胞還在改善造血和實體器官移植、促進抗腫瘤免疫治療、控制炎癥和自身免疫疾病方面具有廣闊的前景[16]。本研究中，三個劑量組6S-5-甲基四氫葉酸鈣均能顯著提高NK細胞的活性，提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣能夠通過提升這些免疫相關細胞活性，從而提高機體的免疫能力，發揮治病防病的重要功能。

特異性免疫屬于后天獲得性免疫，通過T淋巴細胞和B淋巴細胞進行抗原特異性的免疫反應，特異性免疫反應在預防麻疹和流感嗜血桿菌引起的呼吸道疾病等常見傳染病中至關重要[17-18]。為了評價6S-5-甲基四氫葉酸鈣對小鼠體液免疫的影響，本研究測定了給藥后各組溶血空斑數、抗體積數，三個劑量組指標均顯著增加，表明參與抗體合成的巨噬細胞、T和B淋巴細胞亞群的反應性增強。細胞免疫涉及T淋巴細胞及其產物（淋巴因子)，ConA誘導淋巴細胞轉化和DTH反應需要激活的T淋巴細胞對給定抗原的特異性識別，從而增殖和釋放細胞因子，淋巴細胞增殖能力和DTH反應體現了細胞因子誘導巨噬細胞募集和激活的能力。本研究中，三個劑量組DTH反應均增加，中、高劑量組淋巴細胞增殖能力顯著增強，小鼠對T細胞依賴抗原反應的增加揭示了6S-5-甲基四氫葉酸鈣對T細胞的刺激作用。

葉酸是人體必需的維生素，參與體內蛋白質和DNA的合成，它是一碳代謝的重要甲基供體[19]，補充葉酸對人體健康大有裨益[20-21]。本研究結果證明了，6S-5-甲基四氫葉酸鈣能夠明顯增強小鼠特異性和非特異性免疫反應，提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣在免疫增強研究領域具有重要的應用前景和開發利用價值。6S-5-甲基四氫葉酸作為葉酸在血漿中循環最活躍的形式[22]，它可以避免因葉酸代謝酶基因多態性導致的葉酸代謝障礙[23-24]，因而具有更高的生物利用度以及生理活性[25]。目前對于6S-5-甲基四氫葉酸鈣的研發還處在初期階段，未來我們將會積極探索6S-5-甲基四氫葉酸鈣在免疫和炎癥等方面的開發和應用。

綜上所述，6S-5-甲基四氫葉酸鈣具有增強免疫力功能，為后續開發利用奠定了堅實的基礎。