慢性腎臟病患者腸道菌群特征及其與微炎癥因子水平的相關性探討

梁 潔 廖安全 葉昌榮 吳婉倩

廣東省河源市人民醫院腎內風濕免疫科，廣東河源 517000

有關數據調查結果顯示，慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患病率為10.8%，CKD的患病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，終末期CKD患者主要以血液透析、腹膜透析及腎移植為腎臟替代治療方式，雖然能改善患者癥狀，但是遠期預后較差，給患者及其家庭帶來心理及經濟負擔。既往研究表明：在健康人群的胃腸道內寄居著多種微生物[2]，包括對身體有益的微生物群（革蘭氏陽性菌、雙歧桿菌等）、潛在的致病菌（銅綠假單胞菌、大腸桿菌等），這些微生物在人體腸道內處于共生狀態，保持著一種動態的平衡狀態，發揮代謝、營養及增強免疫力的作用，能促進免疫系統發育，維持正常的免疫功能。然而，當該平衡被打破后，將會增加胃腸道疾病的發生率[3-4]。同時，持續的腸道菌群異常會引起系統炎癥，導致患者預后不良。臨床上對于兩者的關系缺乏統一標準[5-6]。因此，本研究以CKD非透析患者及健康體檢者為對象，探討CKD患者腸道菌群特征及與微炎癥因子水平的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年7月至2020年6月河源市人民醫院腎內風濕免疫科收治的35例CKD非透析患者為研究對象，設為觀察組，女15例，男20例，年齡41～78歲，平均（56.95±5.61）歲；體質 量 指 數（body mass index，BMI）18 ～ 27 kg/m2，平均（23.26±3.25） kg/m2；病 程 1～ 7個 月，平 均（3.69±0.72）個月；有飲酒史12例，有吸煙史8例；選擇38名同期健康體檢者設為對照組，女16例，男22例，年齡40～77歲，平均（57.11±5.65）歲；BMI 17 ～ 28 kg/m2，平均（23.31±3.27） kg/m2；體檢人群中，有飲酒史11例，有吸煙史12例。兩組患者一般資料比較，差異無統計意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標準

納入標準：①符合《改善全球腎臟病預后組織指南》[7]中CKD診斷標準，患者腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）＜ 30 ml/（min·1.73m3）；②均完成腸道微生物及微炎癥因子測定，且患者均可耐受；③具有完整的一般資料與隨訪資料。排除標準：①合并精神異常、消化系統疾病或治療史者；②妊娠期、哺乳期或嚴重心、肝功能異常者；③近期服用抗生素、益生菌等影響腸道菌群藥物者；④行腎臟替代治療（包括血透、腹透、腎移植）者。

1.3 研究方法

（1）腸道菌群測定。采用實時熒光定量PCR法測定兩組糞便中長雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、糞腸球菌及大腸桿菌，具體方法如下：①標本采集及總DNA的提取。所有患者入院后均使用無菌采樣盒收集患者24 h內糞便標本，并將其放置于糞菌DNA提取液中。根據E.Z.N.A.R soil試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，生產批號：20184915）說明書完成總DNA的提取，采用NanoDrop2000完成DNA濃度與純度測定。前述操作完畢后采用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳完成DNA提取質量的檢測[8]。②對采集的糞便標本采用PCR法（南京伊若達儀器設備有限公司，生產批號：20193815）檢測糞便中雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、糞腸球菌及大腸桿菌的mRNA表達，設定PCR參數，30℃下操作10 min、42℃處理 30 min、99℃下處理 5 min、5℃下處理5 min，合計完成35個循環，最終10 min延長，溫度72℃。將最終獲得的產物置于濃度為1.5%瓊脂凝膠電泳，且測定完畢后采用Silva數據庫進行對比[9-10]。（2）炎癥因子測定。兩組患者入院后次日清晨取外周空腹血 3 ml，4500 r ，35 min 離心，分離出的血清采用免疫比濁法測定兩組C反應蛋白（c-reactive protein，CRP）水平；采用ELISA法測定兩組白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，試劑盒均購于美國R&D systems公司，生產批號：20191836[11-12]。參考值：CRP參考值＜5 mg/L；TNF-α參考值：0.10～2.31 ng/L；IL-6參考值：0～8 ng/L；（3）相關性分析。采用Pearson軟件對CKD患者腸道菌群特征與微炎癥因子水平進行相關性分析。

1.4 觀察指標

①腸道菌群結果。記錄兩組雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、糞腸球菌及大腸桿菌結果；②炎性因子。記錄兩組CRP、IL-6、TNF-α水平；③相關性分析。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件處理分析數據，計量資料行t檢驗，采用（）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者腸道菌群結果比較

觀察組CKD患者雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；糞腸球菌及大腸桿菌均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組腸道菌群結果比較（，lgCFU/g）

表1 兩組腸道菌群結果比較（，lgCFU/g）

組別 n 雙歧桿菌 嗜酸乳酸桿菌 糞腸球菌 大腸桿菌觀察組 35 6.37±1.12 5.53±0.89 7.41±0.798.95±1.12對照組 38 10.49±1.51 6.78±0.95 6.32±0.677.12±0.83 t值 7.416 6.092 6.778 9.135 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組患者炎性因子比較

觀察組CKD患者炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平均高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者炎性因子比較（）

表2 兩組患者炎性因子比較（）

組別 n CRP（mg/L） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）觀察組 35 7.34±0.71 153.69±21.59 285.34±25.62對照組 38 2.32±0.43 72.45±6.71 114.29±18.43 t值 6.392 8.991 6.031 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 CKD患者腸道菌群特征與微炎癥因子水平相關性

Pearson相關分析結果顯示，CKD患者中炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平與雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌數量呈負相關性（P＜0.05），與糞腸球菌及大腸桿菌數量呈正相關性（P＜0.05）。見表3。

表3 CKD患者腸道菌群特征與微炎癥因子水平相關性

3 討論

既往研究表明[13-14]：CKD與腸道菌群存在緊密的聯系，具有相互影響作用。CKD患者腸道菌群的數量與構成與正常人相比發生一定變化，腸道菌群紊亂亦可影響CKD患者病情，且菌群產生的分子為尿毒癥毒素的重要組成部分。因此，加強CKD患者腸道菌群測定，能夠了解患者微生態失衡的機制，指導臨床治療，避免腸道菌群失調，為CKD診療提供新途徑[15]。本研究中，觀察組CKD患者雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌水平低于對照組（P＜0.05）；糞腸球菌及大腸桿菌均高于對照組（P＜0.05），提示CKD患者常伴有腸道菌群紊亂，主要表現為有害菌的增多及有益菌的減少。通過對腸道微生物進行細致的研究及定量分析，能夠增加對于CKD發生的理解。既往研究表明正常人群腸道內菌群維持相對平衡，但是CKD患者將會引起腸道菌群失衡。本研究中，觀察組CKD患者炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平均高于對照組，提示CKD患者常伴有炎癥因子的高表達，主要是由于CKD患者發病后炎癥在多種因素作用下，引起單核巨噬細胞系統激活，造成機體處于微炎癥狀態。同時，患者發病后機體內的代謝廢物隨著腎臟清除能力的下降而在體內蓄積，從而刺激機體產生炎癥因子，持續的炎癥因子亦可增加CKD發生率[16]。為了進一步分析CKD患者腸道菌群與炎癥因子的關系，本研究結果顯示：CKD患者中炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平與雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌數量呈負相關性，與糞腸球菌及大腸桿菌數量呈正相關性，提示CKD患者腸道菌群與微炎癥狀態有關，加強患者腸道菌群測定能夠指導臨床治療。但是，本研究亦存在諸多局限性，如納入病例數較少，需要加大樣本量進一步驗證。

綜上所述，CKD患者常伴有腸道菌群紊亂，且與微炎癥因子水平存在相關性，期待能夠為臨床治療提供更多參考。