RND外排泵對多重耐藥鮑曼不動桿菌AYE菌株生物被膜形成的影響

王清會，藺 飛，劉獻清，凌保東

(1.成都醫學院結構特異性小分子藥物研究 四川省高校重點實驗室，四川 成都 610500；2.成都醫學院 藥學院，四川 成都 610500；3.成都市金牛區人民醫院 西藥劑科，四川 成都 610500；4.成都醫學院臨床醫學院 第一附屬醫院藥學部，四川 成都 610500; 5.廣元市中醫院臨床藥學辦，四川 廣元 628099)

鮑曼不動桿菌是一種機會性致人類感染病原體，在危重患者中易引起呼吸機、血液和留置裝置感染等問題[1]，該病原體生物被膜的形成有助于醫療器械相關感染及感染持續[2]，同時生物被膜的形成使其耐藥性與致病性大幅度增強[3],導致持續性感染與反復感染的出現[4-6]，使治療感染面臨巨大的挑戰。研究[7-8]表明,生物被膜的形成與外排泵系統、群體感應系統、胞外多糖等相關。本文重點探討多重耐藥鮑曼不動桿菌AYE桿菌RND外排泵基因影響生物被膜形成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 鮑曼不動桿菌標準菌株AYE，以及RND外排泵基因敲除AYE菌株(分別為AYE△adeB、AYE△adeFGH、AYE△adeIJK)，均為本實驗室留存，并對其進行驗證。

1.2 試驗儀器及試劑信息

1.2.1 試驗儀器 恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)、恒溫搖床(Thermo Fisher Scientific)、酶標儀(SpectraMa190)、熒光定量PCR儀(biorad)、正置顯微鏡(Thermo Fisher Scientific)、96孔細胞培養板(科茲莫生物科技有限公司)等。

1.2.2 試劑信息 胰酪大豆胨液體培養基和CAMHB肉湯培養基(購自青島海博生物技術有限公司)，維拉帕米(購自大連美侖生物公司)，奧美拉唑(購自源葉生物)，二甲基亞砜(購自成都市科龍化工試劑廠)，PAβN和CCCP(購自上海皓元生物醫藥科技有限公司)，PBS和RNA提取試劑盒(購自生工生物)、逆轉錄試劑盒和熒光染料SYBR Premix Ex Taq II(購自諾維贊)。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因敲除 使用無標記基因敲除方法[9]分別敲除鮑曼不動桿菌AYE菌株RND外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK基因，具體方法參考文獻[10]。構建應敲除基因的上下游同源序列，以Not1和BamH1雙酶切后插入自殺性載體 pMo130-Telr，進行熱擊轉化，將攜帶同源片段的自殺式載體轉入電轉感受態菌株47055，與標準菌株AYE混合濃集于NC膜上，然后進行篩選鑒定，直至篩選出對應敲除基因突變株，進行測序及實時定量確認。

表1 qRT-PCR檢測外排泵基因表達引物及產物長度

1.3.3 外排泵抑制劑對菌株AYE生物被膜形成的影響 4種外排泵抑制劑包括 PAβN、奧美拉唑、維拉帕米、CCCP，其中PAβN、奧美拉唑、維拉帕米的MIC值均>512 μg/mL，CCCP MIC值為16 μg/mL。最終選擇不影響細菌生長的最大濃度, PAβN、奧美拉唑、維拉帕米為 1/4最低抑菌濃度(MIC)(128 μg/mL)，CCCP為1/2 MIC(8 μg/mL)。

1.3.4 生物被膜形成試驗 使用結晶紫染色法[13]測定鮑曼不動桿菌生物被膜形成情況：以標準菌株AYE作為對照菌株，每個菌株設置6個復孔，用0.9%生理鹽水調整其光學密度為OD600=0.1，接種到96孔細胞培養板中，培養板在37℃靜置培養24 h。用PBS清洗3遍去除浮游細菌，靜置30 min使96孔板晾干；每孔加入200 μL 0.1%結晶紫，染色15 min。將結晶紫輕輕吸出，每孔用無菌PBS輕輕洗3次，靜置30 min使96孔板晾干；在每孔中加入200 μL 95%的乙醇溶液，靜置15 min，使結晶紫完全溶解，測定OD570。

2 結果

2.1 基因敲除情況 qRT-PCR檢測AYE菌株RND外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK基因均成功敲除，獲得AYE△adeB、AYE△adeFGH、AYE△adeIJK菌株。以16S rRNA基因作為內參基因，鮑曼不動桿菌標準菌株AYE的RND外排泵基因敲除前后的表達情況，AYE菌株RND外排泵基因敲除菌株 AYE△adeB、AYE△adeFGH、AYE△adeIJK對應基因已經成功敲除。見圖1。

圖1 鮑曼不動桿菌標準菌株AYE外排泵基因敲除后相關基因表達情況

2.2 外排泵基因敲除菌株AYE生物被膜形成情況 外排泵基因敲除后AYE△adeB、AYE△adeFGH、AYE△adeIJK菌株生物被膜形成量分別為1.59±0.06、2.15±0.19、1.91±0.02，其中外排泵基因adeFGH敲除后生物被膜形成量與敲除前(AYE: 2.31±0.01)相比，差異無統計學意義(P>0.05)，adeB和adeIJK基因敲除后生物被膜形成量低于敲除前(AYE: 2.31±0.01)，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖2。

*：表示P<0.05。

2.3 外排泵抑制劑對鮑曼不動桿菌標準菌株AYE生物被膜形成的影響 在 4種外排泵抑制劑作用下，鮑曼不動桿菌標準菌株AYE的生物被膜形成量(PAβN、奧美拉唑、維拉帕米、CCCP分別為2.14±0.03、2.24±0.02、1.93±0.05、2.09±0.04)均低于對照組(AYE: 2.31±0.01)，差異均有統計學意義(均P<0.05)，其中PAβN形成量最少。見圖3。

*：表示P<0.05。

3 討論

生物被膜是附著在生物或者非生物表面的復雜微生物群落，其產生主要涉及四個階段[14]，第一階段：初始黏附，細菌細胞憑借其動力系統附著在物體表面；第二階段：形成微菌落；第三階段：生物被膜的生長和成熟：第四階段：細菌細胞的釋放。生物被膜的附著由菌毛系統介導，隨著微菌落的形成，開始產生群體感應(quorum-sensing，QS)信號因子[15]，同時胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)、淀粉樣纖維、脂質和核酸等共同構成了生物被膜的細胞外基質，這些因素共同影響著生物被膜的形成與成熟。外層的胞外多糖，為生物被膜的產生和持續提供了物理屏障，QS是一種細胞間的通信機制，可以根據細胞密度同步生物被膜相關基因的表達[16]。同時由于外排泵能夠減少生物被膜內部代謝廢物的積累與細菌密度的增加。研究[17-18]表明，外排泵在一定程度上影響著生物被膜的形成。

鮑曼不動桿菌耐藥性形成過程中RND外排泵發揮著重要作用[19-20]。比較鮑曼不動桿菌標準菌株AYE的外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK敲除前后生物被膜形成情況，結果表明，AYE△adeB、AYE△adeIJK生物被膜形成量明顯降低，而AYE△adeFGH生物被膜形成降低量與對照組相比差異無統計學意義。

在4種外排泵抑制劑作用下，鮑曼不動桿菌標準菌株AYE的生物被膜形成量均有不同程度降低，其中PAβN的降低效果最明顯。PAβN是一種廣譜的外排泵抑制劑[21]，與adeB外排蛋白相結合，PAβN利用遠端結合袋中Phe殘基形成的疏水微環境，使結合單體保持結合構象，防止外排泵擠出任何其他底物，從而導致泵的多重抑制。CCCP為質子動力解偶聯劑[22]，奧美拉唑為H+-K+-ATP酶(又稱質子泵)抑制劑，主要通過破壞跨膜電化學梯度，從而阻斷外排泵能量來源，影響藥物的外排；維拉帕米與膜糖蛋白結合發揮作用，但其逆轉活性不強。4種外排泵抑制劑通過不同的作用機制對外排泵進行抑制后對生物被膜形成的影響程度也不盡相同，其中PAβN作為廣譜外排泵抑制劑對生物被膜的抑制作用最明顯，其次為維拉帕米、奧美拉唑和CCCP4種外排泵抑制劑均能使生物被膜形成減少。

綜上所述，外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK對多重耐藥鮑曼不動桿菌AYE生物被膜的形成有重要作用，外排泵抑制劑PAβN、奧美拉唑、維拉帕米、CCCP對鮑曼不動桿菌AYE生物被膜的形成有不同程度的抑制作用。由于本文僅對外排泵相關基因進行敲除與檢測，未對生物被膜的其他影響因素，如QS系統、EPS等進行深入的研究，有一定的局限性，但外排泵基因敲除后生物被膜的減少表明外排泵基因在生物被膜形成中的重要作用，且外排泵抑制劑對生物被膜形成的抑制作用為臨床鮑曼不動桿菌生物被膜相關治療提供了一種新的思路。