血清微小RNA-155水平評估肺炎支原體肺炎預后的價值

李 敏，孫曉敏，趙二要，張 磊，董利利

(鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童醫院 鄭州兒童醫院 1.呼吸科；2.普內一病區，河南 鄭州 450000)

肺炎支原體肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)是由肺炎支原體引起的肺部感染性疾病[1]。其中，難治性MPP(refractory MPP，RMPP)患兒病情危重，治療難度大，嚴重時可引發心肌損傷、消化系統損傷等多種肺外并發癥，對患兒的生命健康造成極大的威脅[2]。目前MPP的發病機制尚不明確，可能與免疫炎癥損傷、T淋巴細胞亞群Th1/Th2失衡有關。現有研究[3-4]報道微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)參與調控免疫應答、炎癥反應及感染等多種生理過程，且與多種肺部疾病密切相關，因此推測miR-155可能也參與MPP的發生發展。但目前關于miR-155在MPP和RMPP中的研究報道尚不多見。因此，本研究擬通過檢測MPP患兒外周血中miR-155表達水平，探討miR-155在RMPP中的表達意義及與Th1/Th2平衡的相關性，為RMPP及RMPP合并肺外損傷的早期診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2016年12月—2019年6月在河南省兒童醫院住院治療的MPP患兒病歷資料。納入標準：①患兒體征、癥狀、胸部X線片及支原體抗體檢測符合第8版《諸福棠實用兒科學》呼吸系統疾病中的MPP診斷標準[5]；②年齡<14歲；③入院前未進行類固醇激素治療或大環內酯類抗生素治療；④病歷資料完整。排除標準：①既往患有支氣管哮喘、反復呼吸道感染、慢性肺疾病或重癥肺炎未痊愈者；②既往有先天性心臟病或腎、肝及神經系統慢性疾病者；③細菌、病毒及衣原體等其他原因引起的肺部感染。所有患兒家屬均對本研究知情同意。

1.2 分組 患兒入院后接受標準大環內酯類抗生素治療，并根據RMPP標準[6](經大環內酯抗生素正規治療7 d以上，臨床征象加重，仍持續發熱，肺部影像學顯示加重等)分為普通MPP組和RMPP組。再根據住院期間是否發生肺外損傷，將RMPP患兒分為肺外損傷組和無肺外損傷組。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料 統計患兒年齡、性別、熱程、熱峰等一般臨床資料。

1.3.2 實驗室指標 患兒入院24 h內采集外周靜脈血5 mL送檢驗科，①采用全自動五分類血液分析儀檢測白細胞計數(WBC)和中性粒細胞比例(N%)，采用Westergren法測定紅細胞沉降率(ESR)，采用免疫比濁法測定C反應蛋白(CRP)，采用全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。②采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素-4(IL-4)水平，并計算IFN-γ/IL-4比值。③采用qRT-PCR檢測外周血漿中miR-155的表達水平，以U6為內參。

1.3.3 影像學檢查 對所有患兒進行肺部CT或X線檢查，確定肺部病變情況，包括病變部位(雙側或單側)及有無胸腔積液、肺實變等。

2 結果

2.1 基本情況 2016年12月—2019年6月在河南省兒童醫院住院治療的MPP患兒共136例。普通MPP組80例，RMPP組56例；RMPP患兒中肺外損傷組25例，無肺外損傷組31例。

2.2 普通MPP與RMPP一般資料及實驗室指標比較 兩組患兒一般資料及實驗室指標比較結果顯示，RMPP組熱程、WBC、N%、ESR、CRP、LDH、AST、ALT、IFN-γ、IL-4、miR-155水平以及影像學胸腔積液、肺實變的發生比率均高于普通MPP組，IFN-γ/IL-4低于普通MPP組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 普通MPP與RMPP組患兒一般臨床資料及實驗室指標比較

2.3 RMPP患兒miR-155水平與Thl/Th2及炎癥指標的相關性分析 相關性分析結果顯示：RMPP患兒miR-155水平與IFN-γ/IL-4比值呈負相關(r=-0.307，P<0.05)，與ESR、CRP、WBC呈正相關(r值分別為0.273、0.409、0.322，均P<0.05)，與其他指標無相關性(均P>0.05)。見表2和圖1。

圖1 RMPP患兒miR-155與Thl/Th2及炎癥指標的相關性

表2 RMPP患兒miR-155與Thl/Th2及炎癥指標的相關性分析

2.4 RMPP患兒多因素logistic回歸分析 以患兒是否為RMPP為因變量，納入表1中有差異的指標(熱程、WBC、N%、ESR、CRP、LDH、AST、ALT、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4、miR-155、影像學胸腔積液、肺實變，連續變量按照中位值轉化為二分類變量)為自變量，進行多因素logistic回歸分析，結果顯示熱程、CRP、LDH、IL-4、miR-155、胸腔積液及肺實變是RMPP的獨立危險因素(均P<0.05)。見表3。

表3 RMPP患兒多因素logistic回歸分析

2.5 miR-155對RMPP的診斷價值 采用ROC曲線分析miR-155對RMPP的診斷價值，結果顯示：miR-155診斷RMPP的曲線下面積(AUC)為0.742，尤登指數為0.411，最佳截斷值為1.2，特異度和靈敏度分別為78.57%、62.50%，提示miR-155對RMMP具有一定的診斷價值。見圖2。

圖2 miR-155鑒別普通MPP和RMPP的ROC曲線分析

2.6 RMPP患兒是否合并肺外損傷的一般及臨床資料對比 合并及非合并肺外損傷RMPP患兒的一般資料及實驗室指標比較結果顯示，肺外損傷組患兒WBC、N%、ESR、CRP、IL-4、miR-155水平以及影像學肺實變的發生比例均高于無肺外損傷組患兒，IFN-γ/IL-4低于無肺外損傷組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 RMPP合并肺外損傷組與非合并肺外損傷組患兒資料比較

2.7 RMPP合并肺外損傷患兒miR-155水平與Thl/Th2及炎癥指標的相關性分析 相關性分析結果顯示：RMPP合并肺外損傷患兒miR-155水平與Thl/Th2及炎癥指標無相關性(均P>0.05)。見表5。

表5 RMPP合并肺外損傷患兒miR-155與Thl/Th2及炎癥指標的相關性分析

2.8 RMPP合并肺外損傷患兒多因素logistic回歸分析 以RMPP患兒是否合并肺外損傷為因變量，納入表4中有差異的指標(WBC、N%、ESR、CRP、IL-4、IFN-γ/IL-4、miR-155、肺實變，計量資料按照中位值轉化為二分類變量)為自變量，進行多因素logistic回歸分析，結果顯示N%、IL-4、miR-155是RMPP合并肺外損傷的獨立危險因素(均P<0.05)。見表6。

表6 RMPP合并肺外損傷患兒多因素logistic回歸分析

2.9 miR-155對RMPP肺外損傷的診斷價值 miR-155對RMPP肺外損傷診斷價值的ROC曲線分析結果顯示：miR-155診斷RMPP肺外損傷的AUC為0.724，尤登指數為0.470，最佳截點值為1.41，特異度和靈敏度分別為76.00%，70.97%，提示miR-155水平對RMMP肺外損傷具有一定提示意義。見圖3。

3 討論

目前MPP的發病機制尚不明確，但研究[7]均認為免疫炎癥反應及免疫失衡與MPP的發生、發展相關。近年研究[8]發現miRNA在調控多種疾病的免疫應答反應及相關炎癥因子的表達上發揮重要的作用。miR-155是典型的多功能miRNA之一，可參與B淋巴細胞和T淋巴細胞的應答過程，在CD4+、CD25+、Th1等T淋巴細胞的免疫抑制反應中發揮重要作用，參與肺炎的發生、發展。但目前關于不同類型肺炎的研究結果不一[9-10]。陸榮耀等[11]研究發現miR-155在反復肺炎嬰幼兒血清中高表達，是影響嬰幼兒反復肺炎發生的獨立危險因素。但Yang等[12]研究表明，miR-155在肺炎患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中低表達。張薇等[13]研究表明，miR-155在MPP患兒外周血中高表達。因此，關于miR-155與肺部感染性疾病中的水平仍需進一步研究。本研究結果顯示RMPP患兒外周血miR-155水平顯著高于普通MPP，且是RMPP的獨立危險因素，與大部分研究[14-15]結果一致。同時ROC曲線分析顯示miR-155對RMPP的診斷具有較高的靈敏度(62.50%)和特異度(78.57%)，提示miR-155對RMPP具有一定的診斷價值。

CD4+、CD25+及CD8+等T淋巴細胞在肺炎支原體感染后的免疫炎癥反應中扮演重要角色。其中，CD4+按其細胞因子和生物功能的不同可分Th1和Th2兩種，Th1分泌IFN-γ因子，而Th2細胞分泌IL-4因子，因此通常用IFN-γ/IL-4比值來代表機體Th1/Th2細胞優勢狀態。正常條件下Th1/Th2細胞處于動態平衡，以維持機體正常的免疫功能。Th1/Th2的失衡與肺炎、肺結核及MPP等多種肺部炎癥疾病的發生、發展密切相關[16-18]。現有研究[19-20]已證實不同類型不同病情的MPP患兒在Th1/Th2免疫應答上存在差異。李菁等[21]研究發現高菌量MPP患兒BALF中IL-4水平和IL-4/IFN-γ明顯高于低菌量患兒，說明MPP患兒BALF中高菌量可誘導Th2免疫炎癥因子產生，導致Th1/Th2免疫偏移。康妍萌等[22]研究發現重度MPP患兒BALF和血清中IL-4/IFN-γ比值均顯著高于支氣管異物患兒，說明嚴重MPP患兒中存在Th1/Th2失衡。本研究結果顯示，RMPP患兒IFN-γ、IL-4水平明顯高于普通MPP患兒，IFN-γ/IL-4明顯低于普通MPP患兒，提示Th1和Th2細胞免疫反應可能參與RMPP的發病過程，與現有研究結果基本一致。有證據顯示MPP患兒外周血miR-155水平與Th1/Th2、CD3+、CD8+等淋巴細胞水平呈負相關，與炎癥因子呈正相關，推測miR-155對T淋巴細胞亞群的調控可能是其參與炎癥疾病的機制。本研究結果發現RMPP患兒中miR-155與Th1/Th2呈負相關，與CRP等炎癥指標呈正相關，因此推測miR-155可能通過影響T淋巴細胞及炎癥因子水平影響細胞免疫反應，進而參與RMPP的發病過程中。

國內外研究[23]報道，50%以上的MPP患兒會合并肺外損傷，包括消化系統、心血管系統、血液系統及泌尿系統損傷等，其中RMPP患兒肺外損傷發生率明顯高于普通MPP患兒。但目前關于RMPP合并肺外損傷的發病機制尚不明確，其可能與肺炎支原體直接作用、炎性介質引起的自身免疫功能失調有關。近年來研究[24-25]表明miR-155與肺部疾病合并肺外損傷的發生有關，但miR-155在RMPP合并肺外損傷中的作用尚不清楚。因此本研究分析了RMPP合并和不合并肺外損傷患兒的miR-155水平，結果顯示，RMPP肺外損傷患兒miR-155水平明顯高于無肺外損傷組，且是RMPP合并肺外損傷的獨立危險因素，提示miR-155與RMPP合并肺外損傷的發生密切相關。同時ROC曲線分析顯示miR-155對RMPP合并肺外損傷的診斷具有較高的靈敏度(70.97%)和特異度(76.00%)。因此，miR-155可能成為RMPP早期治療和預防RMPP患兒肺外損傷發生的新的標志物和潛在靶點。但本研究相關性分析顯示，肺外損傷患兒的miR-155水平與Th1/Th2指標無相關性，推測miR-155可能不是通過Th1/Th2平衡參與肺外損傷的發生，其引起肺外損傷的機制仍需進一步研究才能獲取確切結論。

綜上所述，本研究認為miR-155在RMPP患兒外周血中高表達，與患兒Th1/Th2平衡密切相關，對RMPP診斷及合并肺外損傷的早期識別具有一定的預測價值。但本研究為小樣本單中心研究，應用于臨床還有一定局限性，因此還需臨床工作者進一步擴大樣本量進行多中心研究。