茯苓-薏苡仁對(duì)慢性心力衰竭作用機(jī)制研究*

楊欽，毛以林

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208

2 湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410005

3 廣東省深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 廣東深圳 518104

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于各種原因引起心肌結(jié)構(gòu)和功能變化，致使機(jī)體不能正常代謝的一組臨床綜合癥。2019年歐洲心力衰竭報(bào)告顯示，CHF5年和10年的生存率分別為56.7%和34.9%[1]。中國的調(diào)查結(jié)果顯示程度相似[2-3]。隨著心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加和患者對(duì)藥物的反應(yīng)效果降低，防治心力衰竭的工作又增加了難度。中醫(yī)藥在治療疑難雜病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步探索。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性心衰不只是心本身的病變，亦與脾肺腎等多個(gè)臟器有緊密關(guān)系[4]，筆者導(dǎo)師毛以林教授在臨床中發(fā)現(xiàn)茯苓-薏苡仁用以治療慢性心衰病人時(shí)療效明顯。有實(shí)驗(yàn)研究表明，以茯苓-薏苡仁為其中主要成分的心康沖劑能有效減輕心肌凋亡，增強(qiáng)心肌收縮力，具有良好的抗心力衰竭作用[5]；也可通過下調(diào)心衰的某些表達(dá)，減輕大鼠的水腫情況，緩解心衰的程度[6]；臨床觀察也表明有改善慢性心衰患者利尿劑抵抗的作用[7]，說明茯苓-薏苡仁確實(shí)對(duì)CHF確實(shí)存在某種療效，但其作用的具體途徑和方式仍有待研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，主要特點(diǎn)是脫離了“1個(gè)藥物、1個(gè)基因、1種疾病”模式，從多層次、多途徑、多靶點(diǎn)的角度來研究藥物疾病機(jī)制[8]，因此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究茯苓-薏苡仁對(duì)CHF的作用方式和途徑，理論上是一個(gè)可行之策，可能為研究中醫(yī)藥作用機(jī)制提供一種不同的思路。

資料與方法

1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；UniProt蛋 白 質(zhì) 數(shù)據(jù) 庫（Universal Protein，https：//www.uniprot.org/）；GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（Human Genes，https：//www.genecards.org/）；OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（Online Mendelian Inheritance in Man，https：//omim.org/）；Perl5.32.1軟 件（https：//www.perl.org/）；R4.0.1 軟 件（https：//www.r-project.org/）；Cytoscape3.8.2 軟 件（https：//cytoscape.org/）；STRING 數(shù) 據(jù) 庫（https：//string-db.org/）；Bioconductor分析基因組科學(xué)數(shù)據(jù)（http：//www.bioconductor.org/）；基 因本體富集（Gene Ontology，GO，http：//geneontology.org/）；京都基因和基因百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https：//www.kegg.jp/）。

2 方法

2.1 茯苓-薏苡仁有效成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中分別檢索茯苓、薏苡仁的有效成分，以口服生物利用度以口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18[9]為過濾條件進(jìn)行篩選，得到中藥有效成分。

2.2 茯苓-薏苡仁靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過UniProt數(shù)據(jù)庫查找“人”基因庫，通過基因名轉(zhuǎn)換，獲得茯苓-薏苡仁的藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.3 檢索疾病靶標(biāo) 以慢性心力衰竭“Chronic Heart Failure”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出疾病預(yù)測(cè)靶標(biāo)，去除重復(fù)項(xiàng)，得到CHF的預(yù)測(cè)靶標(biāo)。

2.4 構(gòu)建成分-疾病作用靶點(diǎn)交集 借助R軟件將茯苓-薏苡仁與CHF文件取交集，繪制韋恩圖。

2.5 繪制“成分-靶點(diǎn)-疾病”中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape3.8.2軟件繪制“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[10]。

2.6 GO富集和KEGG生物通路富集 使用Bioconductor數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集和KEGG富集，進(jìn)行相應(yīng)的功能和信號(hào)通路分析[11-12]。

結(jié) 果

1 藥物靶點(diǎn)與疾病靶標(biāo)交集

經(jīng) 過 OB＞30% 和 DL＞0.18篩 選 后 從 TCMSP檢索到的有效成分24個(gè)，藥物靶點(diǎn)367個(gè)。通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換，得到藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)26個(gè)。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出CHF疾病靶標(biāo)10749個(gè)，將有效成分與疾病靶標(biāo)取交集，最終得到藥物靶點(diǎn)-疾病靶標(biāo)交集25個(gè)，見圖1。

圖1 有效成分與疾病靶點(diǎn)交集

2 藥物與疾病“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape3.8.2軟件繪制“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

3 “藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

基于STRING數(shù)據(jù)庫生成“藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖3；取重要度排名前20名的基因繪制柱形圖，見圖4。

圖3 “藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 “藥物-疾病”基因鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目

4 GO富集

使用Bioconductor數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析，與CHF密切相關(guān)的GO富集條目75個(gè)，取前20位作柱狀圖，主要包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、乙酰膽堿受體活性等。見圖5。

圖5 GO富集條目（前20）

5 KEGG富集

基于KEGG富集得到的信號(hào)通路25條，選取P值排前20位的信號(hào)通路繪制氣泡圖，見圖6。與CHF關(guān)系密切的通路包括神經(jīng)活性配體受體相互作用、鈣信號(hào)通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、cGMPPKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。取富集程度最高的信號(hào)通路神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路繪制通路圖，見圖7。

圖6 KEGG富集通路（前20）

圖7 Neuroactive ligand-receptor interaction通路

討 論

《本草衍義》曰：茯苓、茯神，行水之功多，益心脾不可闕也[13]。《本草正》曰：能利竅去濕，利竅則開心益智，導(dǎo)濁生津[14]。《本草圖經(jīng)》曰：苡仁，心肺之藥多用之[15]。《本草經(jīng)疏》曰：薏苡仁正得之燥氣，兼稟乎天之秋氣以生，故味甘淡，微寒無毒。陽中陰，降也[16]。仲景治胸痹偏緩急者，薏苡附子散主之[17]。茯苓、薏苡仁治療心疾有據(jù)可考，但由于中藥作用的復(fù)雜性和多樣性，作用機(jī)制不十分明確，本文運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析茯苓-薏苡仁作用機(jī)制，以期探明其具體可驗(yàn)證的作用機(jī)制。

本研究KEGG通路分析結(jié)果表明與CHF密切相關(guān)度最高的是神經(jīng)活性配體受體相互作用，其作用途徑可能是通過在缺血和灌注過程中保持線粒體功能來發(fā)揮心臟保護(hù)作用，或是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性類固醇調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性，影響配體-受體相互作用[18]。也有可能是通過神經(jīng)活性配體受體相互作用途徑來維持心肌細(xì)胞凋亡與保護(hù)機(jī)制之間的平衡[19]。神經(jīng)活性配體受體相互作用可能通過改變代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)參與心肌損傷的進(jìn)程[20]。神經(jīng)活性配體-受體相互作用還與人心律失常性右室心肌病密切相關(guān)[21]。盡管該途徑的報(bào)道尚且不多，但多方面研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了它在心血管領(lǐng)域的必要功能和相關(guān)途徑，它可能是CHF的新機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

本研究還富集到鈣信號(hào)通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等，這些通路也可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，血管氧化應(yīng)激，心肌細(xì)胞的收縮和舒張，心肌纖維化，甚至心臟的結(jié)構(gòu)改變[22]。通過對(duì)這些通路的干預(yù)，也可發(fā)揮干預(yù)CHF的作用。

本研究也存在諸多不足之處。①OB＞30%和DL＞0.18的篩選標(biāo)準(zhǔn)是目前公認(rèn)的，但是否會(huì)遺漏一些不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)但在CHF治療過程中起作用的活性成分，參考中藥君臣佐使中的組合，佐使藥比例雖小，作用也不可忽視。②本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，雖研究角度和模式與中藥作用方式途徑相合，但是否能完全清楚準(zhǔn)確的表達(dá)中藥作用方式途徑仍有待進(jìn)一步其他實(shí)驗(yàn)和研究探索。

綜上所述，茯苓-薏苡仁主要通過神經(jīng)活性配體受體相互作用發(fā)揮抗CHF的作用，但其作用的具體機(jī)制，還有待相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為茯苓-薏苡仁抗CHF作用機(jī)制的研究，提供了可行性的理論依據(jù)，為下一步機(jī)制研究奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為CHF的探索提供了一些新見解，也為CHF防治的干預(yù)途徑提供了一些研究方向。