茯苓-薏苡仁對慢性心力衰竭作用機制研究*

楊欽，毛以林

1 湖南中醫(yī)藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南省中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 湖南長沙 410005

3 廣東省深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 廣東深圳 518104

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于各種原因引起心肌結(jié)構(gòu)和功能變化，致使機體不能正常代謝的一組臨床綜合癥。2019年歐洲心力衰竭報告顯示，CHF5年和10年的生存率分別為56.7%和34.9%[1]。中國的調(diào)查結(jié)果顯示程度相似[2-3]。隨著心血管疾病發(fā)生風險增加和患者對藥物的反應效果降低，防治心力衰竭的工作又增加了難度。中醫(yī)藥在治療疑難雜病方面具有獨特優(yōu)勢，值得進一步探索。

中醫(yī)學認為，慢性心衰不只是心本身的病變，亦與脾肺腎等多個臟器有緊密關系[4]，筆者導師毛以林教授在臨床中發(fā)現(xiàn)茯苓-薏苡仁用以治療慢性心衰病人時療效明顯。有實驗研究表明，以茯苓-薏苡仁為其中主要成分的心康沖劑能有效減輕心肌凋亡，增強心肌收縮力，具有良好的抗心力衰竭作用[5]；也可通過下調(diào)心衰的某些表達，減輕大鼠的水腫情況，緩解心衰的程度[6]；臨床觀察也表明有改善慢性心衰患者利尿劑抵抗的作用[7]，說明茯苓-薏苡仁確實對CHF確實存在某種療效，但其作用的具體途徑和方式仍有待研究。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡分析，主要特點是脫離了“1個藥物、1個基因、1種疾病”模式，從多層次、多途徑、多靶點的角度來研究藥物疾病機制[8]，因此運用網(wǎng)絡藥理學研究茯苓-薏苡仁對CHF的作用方式和途徑，理論上是一個可行之策，可能為研究中醫(yī)藥作用機制提供一種不同的思路。

資料與方法

1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；UniProt蛋 白 質(zhì) 數(shù)據(jù) 庫（Universal Protein，https：//www.uniprot.org/）；GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（Human Genes，https：//www.genecards.org/）；OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（Online Mendelian Inheritance in Man，https：//omim.org/）；Perl5.32.1軟 件（https：//www.perl.org/）；R4.0.1 軟 件（https：//www.r-project.org/）；Cytoscape3.8.2 軟 件（https：//cytoscape.org/）；STRING 數(shù) 據(jù) 庫（https：//string-db.org/）；Bioconductor分析基因組科學數(shù)據(jù)（http：//www.bioconductor.org/）；基 因本體富集（Gene Ontology，GO，http：//geneontology.org/）；京都基因和基因百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https：//www.kegg.jp/）。

2 方法

2.1 茯苓-薏苡仁有效成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中分別檢索茯苓、薏苡仁的有效成分，以口服生物利用度以口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18[9]為過濾條件進行篩選，得到中藥有效成分。

2.2 茯苓-薏苡仁靶點的預測 通過UniProt數(shù)據(jù)庫查找“人”基因庫，通過基因名轉(zhuǎn)換，獲得茯苓-薏苡仁的藥物預測靶點。

2.3 檢索疾病靶標 以慢性心力衰竭“Chronic Heart Failure”為關鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出疾病預測靶標，去除重復項，得到CHF的預測靶標。

2.4 構(gòu)建成分-疾病作用靶點交集 借助R軟件將茯苓-薏苡仁與CHF文件取交集，繪制韋恩圖。

2.5 繪制“成分-靶點-疾病”中藥調(diào)控網(wǎng)絡 使用Cytoscape3.8.2軟件繪制“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡[10]。

2.6 GO富集和KEGG生物通路富集 使用Bioconductor數(shù)據(jù)庫進行GO富集和KEGG富集，進行相應的功能和信號通路分析[11-12]。

結(jié) 果

1 藥物靶點與疾病靶標交集

經(jīng) 過 OB＞30% 和 DL＞0.18篩 選 后 從 TCMSP檢索到的有效成分24個，藥物靶點367個。通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換，得到藥物預測靶點26個。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出CHF疾病靶標10749個，將有效成分與疾病靶標取交集，最終得到藥物靶點-疾病靶標交集25個，見圖1。

圖1 有效成分與疾病靶點交集

2 藥物與疾病“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

通過Cytoscape3.8.2軟件繪制“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，見圖2。

圖2 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

3 “藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡

基于STRING數(shù)據(jù)庫生成“藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡，見圖3；取重要度排名前20名的基因繪制柱形圖，見圖4。

圖3 “藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡

圖4 “藥物-疾病”基因鄰接節(jié)點數(shù)目

4 GO富集

使用Bioconductor數(shù)據(jù)庫進行GO分析，與CHF密切相關的GO富集條目75個，取前20位作柱狀圖，主要包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、乙酰膽堿受體活性等。見圖5。

圖5 GO富集條目（前20）

5 KEGG富集

基于KEGG富集得到的信號通路25條，選取P值排前20位的信號通路繪制氣泡圖，見圖6。與CHF關系密切的通路包括神經(jīng)活性配體受體相互作用、鈣信號通路、心肌細胞的腎上腺素能信號傳導、cGMPPKG信號通路、cAMP信號通路、甲狀腺激素信號通路等。取富集程度最高的信號通路神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路繪制通路圖，見圖7。

圖6 KEGG富集通路（前20）

圖7 Neuroactive ligand-receptor interaction通路

討 論

《本草衍義》曰：茯苓、茯神，行水之功多，益心脾不可闕也[13]?！侗静菡吩唬耗芾[去濕，利竅則開心益智，導濁生津[14]。《本草圖經(jīng)》曰：苡仁，心肺之藥多用之[15]?！侗静萁?jīng)疏》曰：薏苡仁正得之燥氣，兼稟乎天之秋氣以生，故味甘淡，微寒無毒。陽中陰，降也[16]。仲景治胸痹偏緩急者，薏苡附子散主之[17]。茯苓、薏苡仁治療心疾有據(jù)可考，但由于中藥作用的復雜性和多樣性，作用機制不十分明確，本文運用中藥網(wǎng)絡藥理學分析茯苓-薏苡仁作用機制，以期探明其具體可驗證的作用機制。

本研究KEGG通路分析結(jié)果表明與CHF密切相關度最高的是神經(jīng)活性配體受體相互作用，其作用途徑可能是通過在缺血和灌注過程中保持線粒體功能來發(fā)揮心臟保護作用，或是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性類固醇調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性，影響配體-受體相互作用[18]。也有可能是通過神經(jīng)活性配體受體相互作用途徑來維持心肌細胞凋亡與保護機制之間的平衡[19]。神經(jīng)活性配體受體相互作用可能通過改變代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)參與心肌損傷的進程[20]。神經(jīng)活性配體-受體相互作用還與人心律失常性右室心肌病密切相關[21]。盡管該途徑的報道尚且不多，但多方面研究的結(jié)果強調(diào)了它在心血管領域的必要功能和相關途徑，它可能是CHF的新機制，需要進一步研究。

本研究還富集到鈣信號通路、心肌細胞的腎上腺素能信號傳導、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、甲狀腺激素信號通路等，這些通路也可導致動脈粥樣硬化，血管氧化應激，心肌細胞的收縮和舒張，心肌纖維化，甚至心臟的結(jié)構(gòu)改變[22]。通過對這些通路的干預，也可發(fā)揮干預CHF的作用。

本研究也存在諸多不足之處。①OB＞30%和DL＞0.18的篩選標準是目前公認的，但是否會遺漏一些不符合篩選標準但在CHF治療過程中起作用的活性成分，參考中藥君臣佐使中的組合，佐使藥比例雖小，作用也不可忽視。②本研究采用網(wǎng)絡藥理學研究方法，雖研究角度和模式與中藥作用方式途徑相合，但是否能完全清楚準確的表達中藥作用方式途徑仍有待進一步其他實驗和研究探索。

綜上所述，茯苓-薏苡仁主要通過神經(jīng)活性配體受體相互作用發(fā)揮抗CHF的作用，但其作用的具體機制，還有待相關實驗進一步驗證。本研究為茯苓-薏苡仁抗CHF作用機制的研究，提供了可行性的理論依據(jù)，為下一步機制研究奠定了數(shù)據(jù)基礎，并為CHF的探索提供了一些新見解，也為CHF防治的干預途徑提供了一些研究方向。