運用網絡藥理學方法探討心痛方治療冠心病的作用機制*

代璐，范金茹，王子焱，王榮，佘瑞寧，張超

湖南中醫藥大學第一附屬醫院 湖南長沙 410007

冠 心 病（Coronary Atherosclerotic Heart Disease，CHD），指冠狀動脈發生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟疾病[1]。報告[2]指出，目前我國冠心病患者達1100萬。盡管經皮冠狀動脈介入術（PCI）在基層廣泛推進和發展，但冠心病的死亡率仍居高不下。大量臨床研究表明[3-5]，在西醫常規治療基礎上，辨證運用中藥復方對改善冠心病患者癥狀及生存率均有較好效果。由此可知，中醫與現代醫學優勢互補、有機結合的確可以給患者帶來最大獲益。

網絡藥理學是是基于網絡觀點從系統水平分析藥物作用機制、發現先導化合物或新適應癥、識別新藥靶點等的一種新的藥物研究策略[6]，其系統性、整體性與中醫整體調控機體的理念相符合。因此，運用網絡藥理學的研究方法，從分子層面挖掘臨床驗之有效的中藥復方治療某種疾病的作用機制是十分可行的。

范金茹教授將冠心病分為發作期和緩解期進行論治。所制心痛方是治療發作期屬痰瘀互結氣郁證的常用方劑，以“肝心同治，間者并行，甚者獨行”為原則成方。目前，經過臨證運用、臨床研究[7]和實驗室研究[8]明確心痛方治療冠心病的臨床有效性，但前階段的研究僅發現抑制炎癥反應和調節鈣穩態這兩條作用通路。對心痛方治療冠心病的其他成分、靶點、通路的作用機制研究尚不系統和全面，故本文旨在通過網絡藥理學方法，通過構建“成分-靶點-通路”網絡對心痛方治療冠心病的機制進行系統研究，為進一步揭示心痛方的藥理作用機制提供理論指導。

資料與方法

1 心痛方化合物的收集與篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[9]（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中查找柴胡、瓜蔞、川芎、郁金、桃仁、蒲黃、白芥子、石菖蒲、甘草9味中藥的有效成分信息及其藥理學信息。根據藥理學特性進行藥物代謝動力學（ADME）篩選，設置生物利用度（OB）≥20%，類藥性（DL）≥0.1。在TCMSP中未檢索到九香蟲的化學成分，在“中國知網”（CNKI）及PubMed中以“九香蟲化學成分”進行檢索，獲得九香蟲的主要化學成分及化學結構式。

2 心痛方靶點的預測與標準化命名

在TCMSP中找出心痛方中藥物（除九香蟲外）有效成分對應的靶點信息，并利用SwissTargetPrediction服 務 器[10]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行補充。在 Uniprot網站（https：// uniprot.org/）輸入靶點蛋白并限定“Review”“Human”檢索，對結果進行標準化處理，并獲得官方使用標簽（Gene Symbol）。通過ChemDraw19.0作圖軟件畫出九香蟲各成分的化學結構，運用SwissTargetPrediction進行ADME篩選，最后將篩選完的成分進行靶點預測，獲取官方名稱（commom name）。

3 冠心病靶點的收集

在 OMIM 數 據庫（https：//omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、DrugBank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）中檢索冠心病疾病靶點。其中對DrugBank數據庫中獲取的靶點進行官方標準化命名；GeneCards數據庫通過Gifts算法[11-12]，可以算出冠心病與靶點的相關度，根據算出的相關度，選取Relevance score≥30的靶點為冠心病靶點。對三個數據庫中的靶點信息進行整合、去重后，獲得冠心病相關靶點。

4 冠心病靶點與心痛方靶點的映射

將獲得的心痛方藥物靶點與冠心病靶點導入VENNY2.1.0[13]（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行映射，得到疾病與藥物的共同靶點，繪制韋恩圖。用 Cytoscape3.7.2軟件[14]進行可視化處理，構建藥物-化合物-疾病-靶點相互作用網絡圖，根據拓撲學相關參數進行分析，獲得心痛方治療冠心病的核心有效成分。

5 心痛方對冠心病作用靶點的PPI網絡的構建及核心靶點的分析

將疾病與藥物的共同靶點導入String數據庫[15]（https：//string-db.org/），繪制心痛方治療冠心病的蛋白-蛋白互相作用網絡圖（PPI）。運用Cytoscape3.7.2對蛋白網絡結構進行可視化處理。根據節點自由度大于平均節點自由度進行拓撲學分析，獲得心痛方治療冠心病的核心靶點。

6 GO富集分析和KEGG通路注釋分析

為了進一步明確靶點蛋白的生物學功能及參與的生物學通路，運用 Metascape數據庫[16]（https：//metascape.org/）對心痛方治療冠心病的核心靶點進行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路注釋分析，其中GO富集分析主要包括細胞組分、生物進程、分子功能三部分，并對富集分析結果進行可視化處理。

結 果

1 心痛方的有效成分

TCMSP數據庫中檢索結果顯示，共獲得心痛方中藥物（除九香蟲外）的有效成分共1375個。將1375個有效成分根據OB≥20%，DL≥0.1進行ADME篩選后，獲得有效成分417個。其中柴胡56個、瓜蔞28個、川芎44個、郁金79個、桃仁33個、蒲黃11個、白芥子9個、石菖蒲32個、甘草125個。其中有8個為柴胡、蒲黃、石菖蒲、桃仁、瓜蔞、川芎、郁金、甘草的共有成分。在中國知網中以“九香蟲”檢索，查找九香蟲成分相關文獻[17-18]，顯示其主要成分共有75個，經ADME篩選后獲得有效成分26個。見表1。

表1 8味藥物共有成分

2 心痛方作用靶點

根據TCMSP數據庫中有效成分靶點信息，并結合SwissTargetPrediction網站在線靶標垂釣，共獲得心痛方有效成分作用的靶點信息268個。將獲得靶點蛋白導入Uniprot進行標準化命名，得到其對應的Gene Symbol。

3 冠心病靶點的獲取

在3個數據庫中檢索冠心病疾病靶點，OMIM數據庫檢索出548個、GeneCards數據庫453個、Drug-Bank數據庫35個，進行整合、去重后獲得冠心病靶點988個。與藥物靶點進行映射，獲得心痛方與冠心病共同作用靶點91個，繪制韋恩圖。見圖1。

圖1 心痛方靶點與冠心病靶點韋恩圖

4 構建藥物-成分-疾病-靶點網絡圖

將所篩選出的基因與其化合物相對應，并以“中藥拼音首字母+數字” 對每一味中藥的化合物進行編號（如：柴胡MOL001645編號為CH1，藥物共有成分以“S+數字”編號），構建網絡文件及屬性文件，通過Cytoscape3.7.2軟件繪制藥物-成分-疾病-靶點網絡圖。本網絡由196個節點、621條邊構成，其中節點表示冠心病、中藥復方藥物、成分、靶點基因，邊表示藥物、成分、疾病、靶點之間的相互聯系。根據“中介中心性”（Betweenness Centrality）進行拓撲學分析，大于Betweenness Centrality平均值0.00568的成分有18個，在Excel中按降序排列，其中排名前十的為：S3、S6、CX2、JXC1、S2、S7、TR9、TR16、JZ1、TR12。由結果可推測花生四烯酸、山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、柚皮苷、楊梅酮等可能是心痛方治療冠心病的主要有效成分。見表2，圖2。

表2 心痛方治療冠心病的核心成分

圖2 藥物-成分-疾病-靶點網絡

5 心痛方作用于冠心病的靶點PPI網絡圖

將2.3獲得的91個心痛方與冠心病共同作用靶點導入String數據庫，構建心痛方治療冠心病的蛋白-蛋白互相作用（PPI）網絡，保存PPI網絡的tsv文件。在Cytoscape3.7.2軟件中，運用NetworkAnalyzer工具計算出tsv文件所構建網絡的屬性值，根據Degree值（Degree值表示節點所發出的邊數，其數值越大，表示該節點在網絡中越重要）的大小進行網絡可視化。以節點自由度大于平均節點自由度進行拓撲學分析，共篩選出46個核心靶點，其中Degree最大45，最小26。排名前十的靶點基因為IL6、AKT1、TNF、VEGFA、CCL2、IL1B、EGF、CXCL8、MMP9、NOS3。

將46個核心靶點導入String數據庫，設置條件minimum required interaction score：highest confidence（0.9），余保持默認設置，構建核心靶點PPI網絡圖。本網絡包括46個節點、171條邊，節點的平均度值：7.43，平均聚類系數：0.517。見圖 3、圖4。

圖3 心痛方與冠心病交集靶點PPI

圖4 核心靶點蛋白PPI網絡

6 GO分析和KEGG分析

運用Metascape數據庫，設置物種為H.sapiens，對 46個核心靶點進行基因功能富集分析和通路注釋分析。

6.1 GO分析 根據分析結果，獲得生物過程（Biological Processes，BP）657個、細 胞 組 分（Cellular Components，CC）33個、分子功能（Molecular Functions，MF）68 個（P＜0.01，FDR＜0.01）（表 2）。運用在線作圖工具微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對部分結果進行可視化處理。其中，生物過程涉及：白細胞的遷移、細胞黏附的調節、細胞分化的負調控、炎癥反應的調節、對氧化應激的反應等；細胞組分包括：脂筏、血小板α顆粒、細胞外基質、細胞質的核周區域、早期內體、RNA聚合酶II轉錄因子復合物、粘附連接、質膜的外側、細胞質囊泡膜；分子功能主要有：細胞因子受體結合、磷酸酶結合、整合素結合、一氧化氮合酶調節活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合、羧酸結合、血紅素結合、肝素結合、金屬內肽酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、趨化因子受體結合、激酶調節活性。根據以上三部分，可以推測心痛方具有多途徑、多功能的作用。

6.2 KEGG分析 為了進一步探析核心靶基因的具體作用通路，將核心靶點輸入Metascape數據庫進行KEGG通路注釋，以P＜0.01進行篩選，共獲得冠心病相關通路245條。主要包括：液體剪切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、節點樣受體（NOD-LIKE）信號通路、JAK-STAT信號通路、甲狀腺激素信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、ErbB信號通路、toll樣受體信號通路等。選取其中24條與冠心病相關通路進行可視化（圖5），其中X軸代表富集因子（Rich factor），Y軸代表通路，氣泡的面積代表富集在該通路上的基因數目，氣泡越大表示富集在該通路上的基因越多，氣泡顏色代表P值。共有41個基因富集在這24條通路上，反向查找靶基因所對應的有效成分，通過Cytoscape3.7.2軟件進行可視化，構建成分-靶點-通路網絡圖（圖6）。可推測心痛方治療冠心病是多通路作用的結果。

圖5 GO富集分析餅狀圖

圖6 GO富集分析部分結果柱狀圖

圖7 心痛方作用靶點KEGG富集分析氣泡圖

圖8 成分-靶點-通路網絡圖

討 論

冠心病，中醫稱為“胸痹心痛”。古今醫家認為痰濁、瘀血與胸痹的發生密切相關[19]。《血證論》有言：“血瘀既久，亦能化為痰水”、王孟英指出“痰飲者，本水谷之悍氣……初則氣滯以停飲，繼則飲蟠而氣阻，氣既阻痹，血亦愆其行度，積以為瘀。”由此可見，痰瘀之間又可互相轉化，互為因果，若二者共同黏附于脈道，阻礙氣血濡養心肌，則發為心痛之癥。“肝心同治”源于全國名中醫王行寬教授提出的“心病治肝”理論[20]，《明醫雜著》提出“肝氣滯則心氣乏”、“肝氣通則心氣和”，范教授在總結王老的學術經驗基礎上，結合中醫“痰瘀理論”，以“甚者獨行”為原則，立疏肝豁痰化瘀之法，研制心痛方[21]。方中柴胡行氣疏肝，郁金、川芎活血化瘀，兼能“搜肝氣”，瓜蔞清痰熱又能“疏肝郁”，配以化瘀止痛之桃仁、蒲黃，祛痰濁之石菖蒲、白芥子以增強除痰瘀實邪之力，佐以蟲類藥物九香蟲，性辛香走竄，擅通走脈絡，搜絡剔邪而又不傷正氣。全方相配，肝氣既順，痰瘀則可順勢而化，實邪得除，肝氣便無郁滯之理，心肝同治，母子相安。

本研究通過數據庫檢索，獲得心痛方治療冠心病的有效成分417個。構建中藥調控網絡，根據“Betweenness Centrality”進行篩選、排序后，推測花生四烯酸、山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、柚皮苷、楊梅酮、豆甾醇等可能為心痛方治療冠心病的主要有效化合物。花生四烯酸作為一種多不飽和脂肪酸，可以通過抑制代謝產物的生成途徑抑制促炎癥因子的表達，起到抗炎和保護血管內皮的作用[22]。在冠心病病程中，大量氧自由基是心肌細胞損傷的標志，心肌細胞的損傷伴隨著細胞凋亡的發生。黃酮類化合物山奈酚、槲皮素、楊梅酮具有抗氧化、清除氧自由基、抗心肌細胞凋亡的作用[23-24]。柚皮苷屬于二氫黃酮類化合物，具有抗缺血、抗氧化、抗炎等作用，其含量與降低心血管病的風險相關[25]。Huang等[26]報導，柚皮苷還可以通過降低caspase-3和caspase-9的活性，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而預防心肌細胞的凋亡。研究指出[27]，異鼠李素可通過抑制動脈血管平滑肌細胞膠原合成起到抗動脈粥樣硬化的作用。

通過構建心痛方治療冠心病靶點PPI網絡，根據Dgree值進行排序，排名前十的靶點基因為IL6、AKT1、TNF、VEGFA、CCL2、IL1β、EGF、CXCL8、MMP9、NOS3。動脈粥樣硬化（AS）血栓形成的過程主要涉及炎癥反應和脂質在血管內壁的沉積兩方面[28]。血管內皮損傷后，由內皮細胞分泌的黏附因子介導淋巴細胞、單核細胞與內皮細胞黏附，遷移至血管內皮下變為組織巨噬細胞，巨噬細胞觸發IL1β、IL6、TNF等炎癥因子的表達，導致平滑肌細胞增殖，斑塊進展[29]。TNF中由巨噬細胞產生的TNF-α可以通過對內皮產生毒副作用，引起血管內皮損傷、促進黏附分子的表達，使巨噬細胞產生更多的TNF-α，增加斑塊的易損性[30]。另一方面，血管內皮細胞分泌的趨化因子也是介導細胞黏附的重要因素之一。CCL2、CXCL8屬于CXC類趨化因子。這類趨化因子可以通過活化血小板，加速血小板的聚集、黏附和釋放，加劇AS進程、血栓形成[31]。

通過KEGG富集分析推測本方治療冠心病可能是通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、液體剪切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶（Akt）信號通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、toll樣受體信號通路、Jak-STAT信號通路、節點樣受體（NOD-LIKE）信號通路、細胞凋亡、甲狀腺激素信號通路發揮作用。

綜上所述，心痛方治療冠心病是多成分、多靶點、多途徑的，與單體藥物相比較，復方作用更為全面、療效更加穩定。既往實驗研究表明，心痛方主要通過抑制炎癥因子的釋放、抑制黏附分子的表達、調節Ca2+穩態等途徑干預冠心病粥樣硬化的發生、變化。與本研究推測的作用靶點、生物過程和作用通路基本相符。除此之外，本研究還推測出心痛方治療冠心病還可能與細胞凋亡、MAPK信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關。可以此為理論基礎進行下一步的實驗研究。