大鼠潰瘍性結腸炎模型的建立*

馬秀蘭，王秀萍，王佳林，王藝臻，朱西杰，2

1 寧夏醫科大學中醫學院 寧夏銀川 750004

2 寧夏醫科大學附屬回醫中醫院 寧夏銀川 750004

潰瘍性結腸炎（UC）為結腸癌前病變和臨床難治病，是一種主要累及直腸、結腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥[1]，屬于炎癥性腸病（IBD）范疇，臨床主要表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便[2]。UC的病因及發病機制尚未明確，而潰瘍性結腸炎動物模型是研究潰瘍性結腸炎發生機制和評價相關藥物效果的必不可少的工具，故對UC模型制備方法的研究具有重要的意義。近些年，隨著研究的深入，關于UC模型的制備，有藥物法、免疫法、中藥法等，但TNBS誘導的UC模型是公認的，有著造模成功率高，造模周期短的優點[3]。本課題組在前期研究中，積累了一定經驗。因此，TNBS可作為潰瘍性結腸炎模型的制備誘導劑。本研究對TNBS的造模方法進一步探討，驗證了其造模時間短、陽性率高、操作簡便。

TNBS模型能夠很好地模擬潰瘍性結腸炎的慢性復發過程，癥狀和組織學改變與人類UC相似，其模型呈慢性炎癥變化，病程長，穩定性好[17]。研究發現，實驗的最佳造模劑量為100～150mg/kg[18]，一次性直腸給藥即可，發生的炎癥可維持7～8周，急慢性期分界約在3周，可明確的控制。TNBS引起IL-12介導的Th1細胞免疫性反應，且TNF-α、IFN-γ含量增高[19]。該模型制備過程中，簡單易行、重復性好、造模時間短，并且經濟實用，適合于對防治藥物的篩選和研究，符合本實驗后期的研究[20]。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，雄性，體質量150～220g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心屏障，許可證號SCXK（寧）2020-0001。

1.2 實驗試劑 ①10%水合氯醛；②2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitro-benzene sulfonicacid，TNBS）；③無水乙醇；④4%多聚甲醛，購買自上海尚寶生物科技有限公司；⑥尿糞便隱血定性檢測試劑盒（購買自信帆生物技術有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 試劑配置 50%乙醇：用蒸餾水稀釋無水乙醇至50%，4℃保存；TNBS-50%乙醇混合溶液：將5%TNBS溶液與50%乙醇溶液等按2：1體積混合，4℃保存待用。

2.2 模型制備 采用TNBS灌腸法制備潰瘍性結腸炎大鼠模型，大鼠造模前禁食不禁水36h。隨機留取8只動物作為空白對照組，其余大鼠10%水合氯醛（0.4mL/100g）腹腔注射麻醉后，使用硅膠管蘸取30%甘油潤滑，輕插入肛門約8cm，150mg/kg（0.45mL/100g）注入 5%TNBS+50% 乙醇[21]（2： 1體積）混合液，然后捏緊肛門提尾倒放3min后，放回籠中，采用頭低腳高位30～60°，充分保暖，自然蘇醒，常規飼養[22-23]。

結 果

1 疾病活動指數（DAI）評分

造模后觀察大鼠每日腹瀉、血便及體重情況，記錄大鼠的一般情況[24]。日常觀察：精神萎靡，懶于活動，大鼠飲食飲水量明顯減少，體重明顯下降，消瘦，出現身體蜷縮，毛發豎立，行動遲緩（見圖1）；大便稀溏，肛周污穢（見圖2）；大便次數明顯增多，軟便或稀便（見圖3）；大便末端有黏液或膿點，便血（見圖4）等表現。DAI評分：造模3d后，綜合大鼠體重下降百分率（體重不變為 0；1～ 5為 1分；6～ 10為 2分；11～15為3分；大于15為4分），糞便性狀（正常為0；半稀便為1分；稀便為3分）和便血（隱血陰性為0分；隱血陽性為1分；肉眼血便3分）進行評分。DAI[25]＝（體重下降分數＋糞便性狀分數＋隱血分數）/3，體重下降5%計分為1分。DAI綜合評分介于0～4分，0分代表正常，4分代表炎癥最大活動度。

圖1

圖2

圖3

圖4

造模3d后，殺檢驗證造模成功后，隨機抽取10只模型大鼠，進行DAI的計算，造模效果顯著，為后續試驗的開展奠定基礎。見表1。

表1 造模后隨機大鼠DAI分數分析

2 黏膜組織學評分

觀察結腸黏膜組織的病理學變化，并對炎癥損傷進行大體形態評分。取距肛門8cm的結腸組織（見圖5），沿縱軸切開，冷生理鹽水洗凈，稱重計算結腸指數；平鋪固定，觀察大體形態，用1mm2的網格紙測量出潰瘍面積，計算潰瘍指數。評分標準[25]：黏膜無損傷，0分；局部充血水腫但沒有糜爛，潰瘍形成，1分；有線性潰瘍形成但沒有明顯炎癥，2分；有潰瘍，且僅有一處出現炎癥，3分；沿結腸長軸兩個或以上部位有潰瘍形成和炎癥，但潰瘍﹤1cm，4分；有多處潰瘍和嚴癥，且潰瘍和炎癥沿結腸縱軸超過1cm，5分。

圖5 結腸黏膜肉眼可見潰瘍、血痂

3 組織形態學觀察

取病變最明顯結腸段長度約1cm，4%多聚甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。肉眼可見病變結腸水腫，腸壁增厚，腸道黏膜有大小不定的潰瘍面。鏡下可見結腸黏膜糜爛、潰瘍、隱窩膿腫、杯狀細胞消失，固有層中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，壞死灶周邊上皮充血，間質層有嗜中性、嗜酸性粒細胞和炎細胞浸潤，黏膜下層結締組織增生，有大量炎細胞浸潤，以中性粒細胞為主[26-27]。見圖6。

圖6 結腸切片

4 鄰聯甲苯胺法檢測大便潛血

血紅蛋白具有過氧化物酶樣作用，以催化H2O2作為電子受體使色原鄰聯甲苯胺氧化呈鄰偶氮苯甲而顯藍色，其顏色深淺與血紅蛋白含量成正比，又稱糞便隱血實驗。用竹簽挑取少量糞便，放入24孔板中。然后依次滴加O-tolidine solution2～3滴。混勻后再加入2～3滴配置好的氧化劑，混勻后，立即觀察顏色變化。2min內有藍色出現，提示糞便含有血紅蛋白（Hb）或糞便隱血實驗陽性。陰性：2min內不顯色；陽性（+）：10s后淺藍色漸變為藍色；陽性（2+）：加入試劑后初顯淺藍色，逐漸呈明顯藍褐色；陽性（3+）：加入試劑后立即呈現藍褐色；陽性（4+）：加入試劑后立即呈現藍黑褐色。見圖7。

圖7 （左邊為10s顯色，右邊為2min顯色）

討 論

迄今，已經提出了多種潰瘍性結腸炎動物模型的制備方法，但廣泛使用的是TNBS誘導的UC模型。該造模方法使用TNBS和50%乙醇混合液，利用50%乙醇損壞腸道黏膜屏障，使蛋白裸露，TNBS直接作用于腸黏膜，導致炎癥的發生[28]。本實驗發現，3d左右大鼠均有UC癥狀出現，或精神萎靡，或稀便，或黏液血便，或體重明顯下降，或均可見；病檢可見：結腸黏膜糜爛、潰瘍、隱窩膿腫，大量炎細胞浸潤等。該造模方法具有時間短、動物耐受性好的優點，且該法采用灌腸，藥物直接作用于腸道，造模成功率高，易操作，易于推廣[29]。在模型制備過程中，可通過糞便形態和大鼠體重的監測，明確腸道炎癥的輕重和病情的變化。通過對近年來國內外關于潰瘍性結腸炎模型動物的選擇（如年齡、體重）、造模方法進行歸納總結及比較，自身采用TNBS法，成功制備潰瘍性結腸炎模型，旨在為潰瘍性結腸炎發病機制研究及新藥開發提供有益參考。

1 潰瘍性結腸炎模型制備

1.1 三硝基苯磺酸（TNBS）模型 TNBS是一種有機酸半抗原，和乙醇配比成混合物，利用乙醇損害屏障功能，使得TNBS向腸壁滲透，使得裸露的蛋白與TNBS結合形成自身抗原，造成機體以Th反應為主的免疫反應，形成以腸壁潰瘍、增厚、狹窄、肉芽腫為特征的節段分布的透壁性炎癥，結腸上皮黏膜出現慢性期淋巴細胞或巨噬細胞浸潤[4]。

1.2 惡唑酮（OXZ）模型[5-6]惡唑酮多采取直腸給藥，可引起嚴重的結腸炎。惡唑酮制備的小鼠結腸炎病變位于遠端結腸，主要作用于黏膜和黏膜下層，主要表現為：大便次數增多、稀便、便上有黏液或膿點，肛周有糞便粘連等，或可見黏液血便，腹腔內可見大量腹水，結直腸水腫擴張、腸壁顏色變暗，變薄，形成偽膜，腸道黏膜充血水腫、糜爛和淺潰瘍形成；黏膜下水腫、杯狀細胞和腺體減少，固有層有彌漫性中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，黏膜下淋巴細胞增生[7]。

1.3 葡聚糖硫酸鈉（DSS）模型[8]DSS是一種水溶性硫酸多糖體，可損傷腸上皮，致使固有層和黏膜下層直接與腸道細菌和抗原接觸，從而引發炎癥；DSS可直破壞腸道屏障完整性，改變結腸黏液層菌群變化，致使腸內細菌損傷上皮細胞，使結腸緊密連接蛋白和緊密連接相關蛋白occludin、Zo-1表達下降、結腸黏膜屏障緊密性降低和腸道菌群失調，從而導致急性結腸炎的發生[9]。模型表現為：體重減輕，直腸出血、血性腹瀉、潰瘍、粒細胞浸潤、上皮細胞喪失和嗜中性粒細胞浸潤[10]。優點：DSS采用直接飲用的方式，故劑量及時間易控，可制備急、慢性結腸炎便于研究；缺點：建模周期長，費用高、耗時長，模型動物致死率高。其UC模型制備操作簡單，但DSS液濃度的把控是模型成功與否的關鍵，研究中多用的是體積為3%或者4%的DSS液，最適濃度還待研究[11-12]。

1.4 2，4-二硝基氯苯和醋酸復合法[13]DNCB是一個半抗原，與組織蛋白結合可激發T淋巴細胞依賴的免疫反應，誘發大鼠發生變態反應，該混合溶液灌腸破壞結腸黏膜屏障，產生炎癥，建立大鼠UC模型[14]。該方法優點如下：病理學變化符合UC特征，可根據模型鼠的表現，按照時間分為潰瘍期：8周內均可見結腸黏膜充血水腫，明顯的潰瘍形成及全層性炎癥細胞浸潤和隱窩膿腫形成；潰瘍愈合期：6周后黏膜充血水腫減輕，中性粒細胞浸潤消失，以淋巴細胞為主[15]。此方法UC模型可維持16周以上，克服了單純DNCB法病程短、自愈性強的弱點，為觀察藥物療效提供了有利的條件。此方法易復制，操作簡單，模型動物的存活率較高，但易自愈[16]。

2 麻醉藥物的影響

水合氯醛是無色透明的白色結晶，味微苦，有特殊臭味，易潮解，在空氣中徐徐揮發，易溶于水、醇、氯仿和乙醚。不耐高熱，宜密封避光保存于陰涼處。本品對呼吸有一定抑制作用，大劑量則抑制延髓的呼吸中樞和血管運動中樞，出現呼吸抑制，血壓下降。故本品的保存和使用都需要特別注意。①臨用前現配制，不可久存，防止分解，剩余的藥液應棄用。②靜脈注射時，絕不可將藥液漏出血管之外的周圍組織；配用濃度：用生理鹽水配制時不超過10%，醇溶液不超過5%。濃度過高時，會發生溶血作用。③水合氯醛的劑量控制不佳，或注射部位過深，損傷腸道，均可能引起腸梗阻的發生；水合氯醛麻醉后，動物容易腹脹而死，考慮為濃度過高引起，給藥原則是一次性給齊，切記多次給藥，否則腹脹發生率明顯增高。④本品深麻醉劑量和致死劑量接近，故實驗前，應至少禁食24h，保證動物體重處于一個穩定水平，根據造模當天的體重精確計算麻醉劑量。⑤水合氯醛能降低新陳代謝，抑制體溫中樞，故在深麻醉時，可顯著降低體溫，因此麻醉時及麻醉后都要注意保暖，給予動物毛巾蓋被或置于厚而柔軟的毛巾上，進行操作，尤其冬天。

3 實驗改進

3.1 麻醉藥物使用 實驗過程中廣泛使用的麻醉藥物水合氯醛[30]，存在藥物的濃度和劑量較難控制，對動物的刺激性大，動物死亡率高的缺點，為避免此缺點，實驗操作過程中，嚴格掌握藥物劑量，按照禁食后造模當天大鼠體重進行計算，現配現用，腹腔注射時，與助手相互配合，采取倒置姿勢，防止針尖傷及腹腔臟器，嚴格按照腹腔注射方法開展。

3.2 灌腸操作 TNBS灌腸傳統器材為硅膠管，灌腸過程中，灌腸液容易溢出，且灌液后拔出時，易帶出液體，影響造模效果及模型的穩定性；操作過程中，選用較硬的塑料管，用石蠟油潤滑，便于插入腸道，灌液后，提尾倒置3min，并采取頭低腳高位，使藥液充分留在腸道內，使得模型穩定性高。

3.3 動物和造模藥物選擇 大鼠壽命約2.5～3年，正常飼養大鼠，6～8周齡，體重達180～220g，10周齡后體重達400g趨于穩定，選用體質量180～220g的SD大鼠，該時期腸道對TNBS的敏感性較強，灌腸后，3d即可出現典型的潰瘍性結腸炎癥狀，節省造模時間，對于TNBS的灌腸濃度也進行改進，予以5%TNBS+50%乙醇（2：1體積混合）混合液灌腸1次即可，造模效率高，癥狀典型，造模時間短[31]。

3.4 造模時間 小鼠禁食24h后仍可能有糞便堆積于結腸處，將禁食時間延長至36h，則結腸處糞便排空比較完全，造模時，大鼠糞便明顯較少，藥液流出減少。

動物模型的成功制備，是后續實驗開展的基礎。TNBS制備的潰瘍性結腸炎模型，能客觀的反映人體臨床UC病癥，但同時存在許多的不足，如模型表現單一，模型自愈能力較強等。如何解決模型的維持問題，是動物實驗及后續實驗開展的重中之重，也是廣大學者的研究熱點。根據自己的實驗操作，進行簡要介紹，以期對同類研究有借鑒作用。