血液制品病毒安全性控制措施研究進(jìn)展

黃進(jìn)英

【摘要】文章主要是分析了血液制品染菌的危害，在此基礎(chǔ)上講解了細(xì)菌污染途徑及控制措施，最后探討了幾種有效能夠滅活病毒的方法，望可以為有關(guān)人員提供到一定的參考和幫助。

【關(guān)鍵詞】血液制品;病毒滅活;原理;安全性

【中圖分類號】R392-33 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.210

前言

血液制品主要是從一些健康的血液中通過分離、純化或由DNA重組技術(shù)所創(chuàng)新制備出來的白蛋白類、球蛋白類以及凝血因子類等，這些血液制品可以有效的在急救、疾病預(yù)防所需要用到的藥物上，血液制品的安全是人們共同關(guān)注的重要問題，為此如何有效的去除其中的病毒是科學(xué)人員應(yīng)當(dāng)不斷進(jìn)行探索和解決的難點(diǎn)。

1 ?血液制品染菌的危害

血液制品污染引起的菌血癥最初是通過輸血并發(fā)癥來的。雖然菌血癥的發(fā)病率不高，但會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。據(jù)報道，1986年至1989年，美國共有7例患者因輸注細(xì)菌污染的血小板而死亡，盡管大多數(shù)液體血液制品在污染后可能出現(xiàn)明顯的生物膜、霉菌團(tuán)和絲狀物，或液體渾濁、產(chǎn)生顆粒和氣體，這些都可以通過清晰度檢測出來，但對于那些單瓶凍干血液制品在分裝或凍干過程中，細(xì)菌感染后不易被檢出，對患者造成了一定的威脅。

2 ?細(xì)菌污染途徑及控制措施

細(xì)菌污染可能發(fā)生在整個血液制品的生產(chǎn)過程中。潛在的有害細(xì)菌通常來自原料或個人接觸受污染的產(chǎn)品。由于細(xì)菌污染途徑的多樣性，通常很難控制被污染的細(xì)菌。因此，為可以制備安全可靠的血液制品，至少應(yīng)從原血漿、原材料和包裝過程的質(zhì)量控制方面采取到了有效的控制措施。

2.1原料血漿污染

在血液收集和血漿分離過程中消毒效果不佳，血液收集前的消毒效果不佳，血液收集器和血漿容器的不完全消毒將直接影響原始血漿的質(zhì)量。結(jié)果表明，主要污染細(xì)菌是G B細(xì)菌。在血液收集和血液捐贈的消毒作用和血漿中的污染細(xì)菌中檢測到細(xì)菌之間存在一定的關(guān)系。孤立的細(xì)菌主要是G B細(xì)菌。因此，在血液收集前嚴(yán)格的消毒和無菌操作是確保血漿無菌性的重要前提。按照世界衛(wèi)生組織（1995年版）的規(guī)定，應(yīng)以一種方式對血液供血的靜脈刺穿部位的皮膚，以確保血液收集是沒有細(xì)菌的。當(dāng)血液按照無菌程序收集到容器中時，原料血漿的最大細(xì)菌計(jì)數(shù)應(yīng)在投料前控制50cfu/ml。涂層分離應(yīng)在無菌封閉的塑料袋系統(tǒng)中進(jìn)行。防止分離血漿再次被細(xì)菌污染，應(yīng)該在6小時內(nèi)冷凍并儲存-25℃。

2.2原輔料的污染

因?yàn)槎喾N原料和輔助材料如糖，酒精或一些化學(xué)試劑，輔料、包括生產(chǎn)水、可能導(dǎo)致由于微生物污染，原料和輔助材料如氨基酸和使用的含有副產(chǎn)品的細(xì)菌污染在靜脈內(nèi)免疫球蛋白的制備中應(yīng)計(jì)數(shù)細(xì)菌，并且在使用前應(yīng)該消毒并過濾滅菌原料和過濾，并且應(yīng)該進(jìn)行消毒和過濾，每次進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌計(jì)數(shù)制定了原料和輔助材料，以及相應(yīng)的許可和排斥限制標(biāo)準(zhǔn)。

2.3分裝過程的污染

為可以保證滅菌系統(tǒng)的安全性和無菌包裝質(zhì)量的可靠性，在滅菌和過濾前應(yīng)對濾膜的泡點(diǎn)進(jìn)行檢測。無菌室的清潔是保證產(chǎn)品無菌質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。FDA指出，保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵是在極高的環(huán)境質(zhì)量條件下對產(chǎn)品進(jìn)行包裝和密封。無菌室中的微生物含量不應(yīng)超過25 CFU/10立方英尺是可以接受的。我國藥品生產(chǎn)管理標(biāo)準(zhǔn)中無菌室的無菌等級是萬級≤1cfu/平均。工人的頻繁活動導(dǎo)致灰塵附著的細(xì)菌污染產(chǎn)品。按照人們在無菌室中的人們的活動的粒子狀態(tài)，從靜態(tài)狀態(tài)產(chǎn)生到快速移動狀態(tài)的顆粒可以產(chǎn)生100000/min-3千萬/min。因此，分配人員應(yīng)加強(qiáng)無菌概念和無菌手術(shù)技術(shù)，定期在分配人員手指上進(jìn)行細(xì)菌文化，并為分配人員和血液產(chǎn)品建立一個系統(tǒng)。在儲存或運(yùn)輸過程中，由于擠壓，容器損壞，因此，選擇高質(zhì)量的儲存容器非常重要。

3 ?經(jīng)血傳播的病原體

理論上，如果病毒感染時出現(xiàn)病毒血癥，則可能通過輸血和血液制品傳播。經(jīng)確認(rèn)的血源病毒包括HIV、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒和G型肝炎病毒、輸血傳播病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人T淋巴細(xì)胞白血病病毒、EB病毒、人類皰疹病毒-8、人細(xì)小病毒B19、西尼羅河病毒等。在采取有效的原始血漿篩查和病毒滅活/清除措施前，報告了HIV、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV、TTV、B19等血液制品。突變病原體是一種只含一種蛋白質(zhì)而不含核酸的病原體，目前還沒有證據(jù)表明它可以通過血液制品傳播，但近年來，又有一起疑似輸血感染凝血因子Ⅷ的病例報道。世界各國已經(jīng)進(jìn)行了更為準(zhǔn)確的風(fēng)險評估，尚不能排除這些風(fēng)險。在生產(chǎn)血液產(chǎn)品的過程中，可以通過無菌過濾除去細(xì)菌，寄生蟲和其他病原體，這不會對血液產(chǎn)品的安全構(gòu)成威脅。

4 ?獻(xiàn)漿員的遴選與病原體檢測

原料血漿的質(zhì)量是保證血液制品安全的首要條件。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，世界各國已經(jīng)形成了一套嚴(yán)格的血漿采集和供應(yīng)體系。以美國為例，F(xiàn)DA從1973年開始對血漿采集和供應(yīng)機(jī)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)督管理，通過質(zhì)量保證、血漿捐獻(xiàn)者資格認(rèn)證、臨床試驗(yàn)認(rèn)證、實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證、藥物警戒等五大質(zhì)量體系，建立了一套完整的管理體系和監(jiān)測體系，血漿采集/處理、檢疫/儲存/處置系統(tǒng)包括血漿供體篩查、檢疫隔離、血漿檢測等五個安全環(huán)節(jié)，事故監(jiān)測和調(diào)查有效保障了血漿采集的安全和原料血漿的質(zhì)量。目前，血液產(chǎn)品僅由中國等離子交換收集的固定健康人血漿產(chǎn)生。從理論上講，風(fēng)險很小。中國有超過100個血漿分離站，由各種血液制品企業(yè)進(jìn)行操作和管理，并嚴(yán)格受到國家的監(jiān)督。其管理系統(tǒng)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本達(dá)到了歐洲和美國發(fā)達(dá)國家的水平。首先，有必要嚴(yán)格選擇血漿捐贈者，包括健康狀況，體檢和驗(yàn)血。只有令人滿意的結(jié)果只能提供血漿。在血漿收集后，一系列病毒試驗(yàn)應(yīng)在單血漿上進(jìn)行，并預(yù)先生產(chǎn)的混合血漿，以確保沒有病毒污染。各國都出臺了相關(guān)規(guī)定或指導(dǎo)方針，并嚴(yán)格對原漿病毒檢測、血漿篩查方法、僅進(jìn)行血清學(xué)檢測，由于檢測靈敏度等局限性，病毒抗體在陽轉(zhuǎn)血漿樣本內(nèi)潛伏期（窗口期）會產(chǎn)生不可避免的誤解，導(dǎo)致部分血液制品（如脆性凝血因子VIII）傳播血源病毒，因此自上世紀(jì)90年代以來，發(fā)達(dá)國家在加強(qiáng)病毒滅活/去除過程的同時，提高了核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)，提高了血液制品的檢測水平。在我國的藥典中，血液產(chǎn)品的血漿血漿應(yīng)通過氨胺轉(zhuǎn)移酶，乙型肝炎表面抗原，HIV1/2抗體，HCV抗體檢測，NAT測試，歐洲藥物管理，單次失敗需要HBsAg，HIV1/2ARIBODIES，HCV抗體，HCSAG，HIV1/2抗體，HCVRNA，此外，病毒滅活的混合血漿增加了B19DNA和HAVRNA兩種測試項(xiàng)目，用于產(chǎn)生抗D免疫球蛋白混合血漿增加檢測B19DNA。按照美國藥品和食品管理局發(fā)布的指南，原料血漿應(yīng)進(jìn)行HBSAG、HiVRNA、HCV抗體和HCV RNA檢測，此外，F(xiàn)DA還建議生產(chǎn)商進(jìn)行B19 DNA檢測，以確保血液制品的安全性，同時遵守相關(guān)法律法規(guī)，許多血液制品制造商都加入了國際血漿蛋白治療配方，并自愿對少量混合血漿進(jìn)行檢測，如CSLBehring、Octopharma等公司自愿對少量混合血漿進(jìn)行HiVRNA、HAVRNA、B19DNA檢測。

5 ?檢疫期管理

原料檢疫期的管理是指按照試驗(yàn)結(jié)果提供的原料血漿生產(chǎn)的技術(shù)措施，并在單位血漿站提供的固結(jié)原料血漿的一段時間之后，以及再血漿的血漿樣品按照測試結(jié)果進(jìn)行測試。國家食品和藥物管理局于2007年發(fā)布相關(guān)規(guī)定，規(guī)定原料血漿的檢疫期不低于90天，即收集和測試原料血漿體90天，合格的原料血漿只能在樣品的質(zhì)粒血漿中進(jìn)行測試和合格。2008年，進(jìn)一步規(guī)定，如果血液制造商增加病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑以在酶聯(lián)免疫吸附測定的基礎(chǔ)上檢測血漿樣品，則每日起始時間限制不小于60天。歐洲和歐洲等發(fā)展國家美國使用NAT篩查病毒篩查原料血漿，從而縮短窗口，因此，制造商本身通常使用或確定60天結(jié)賬期。檢疫時間管理的管理原料血漿可以有效降低缺乏的風(fēng)險在窗口期間檢查，這是能夠有效控制到了原料血漿的有效措施之一。

6 ?光化學(xué)病毒滅活方法

補(bǔ)骨脂素光化學(xué)法是使用其化學(xué)光敏性與致病微生物的核酸或蛋白質(zhì)結(jié)合，并且在光的條件下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，使病原體滅活并且病毒不能復(fù)制，從而有效地滅活病毒在血漿中。病毒滅活方法可以有效地滅活大多數(shù)DNA病毒，RNA病毒，脂質(zhì)涂覆的病毒和非脂質(zhì)涂覆的病毒在血漿中，但對于光化學(xué)的抗性細(xì)小病毒而言是無效的。因?yàn)榕Ｄ倘┕饣瘜W(xué)方法對病毒核酸直接影響，但對血漿中的其他蛋白質(zhì)成分幾乎沒有影響，它通常用于滅活血小板和凝血因子。亞甲藍(lán)是一種含正電荷的吩噻嗪衍生物，由Heinrich Caro于1876年首次合成。亞甲藍(lán)化學(xué)方法是利用theraflex亞甲藍(lán)血漿系統(tǒng)在輕量條件下形成單線氧或自由基，破壞原結(jié)構(gòu)核酸對病原體進(jìn)行殺菌，是我國唯一批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的技術(shù)，而核化學(xué)病毒的核化學(xué)方法是近年來光volumy研究的熱點(diǎn)之一，它利用紫外光或可見光照射和氧化傳遞電子，仍在破壞核酸骨架以使病毒失活。該方法可以有效地滅活產(chǎn)物中的病原細(xì)菌，對蛋白質(zhì)含量沒有明顯影響。核魚素是人體的必需維生素，照明后的代謝物與人體相同。因此，通過該方法制備的血液產(chǎn)品對人體造成較小。一方面，它會導(dǎo)致核酸的突變，阻礙核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的失敗;另一方面，自由基的生產(chǎn)引起光相化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和病毒失活。這種方法可以用于病毒在血小板中的滅活，但它們的失活時間影響血小板的質(zhì)量，非活性時間越長，血小板損傷的變化越大，蛋白質(zhì)濃度會影響滅活效果，蛋白質(zhì)濃度越高的情況下會使得紫外線穿透力越弱，滅活效果越差。

7 ?病毒滅活/去除工藝

血液制品的病毒失活/去除過程是能夠有效的防止到了血液產(chǎn)品中血型病毒傳播的關(guān)鍵措施。各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的相關(guān)法規(guī)/指南是強(qiáng)制性文件，也是制造商關(guān)注的關(guān)鍵過程鏈接之一。2002年，國家食品和藥物管理局發(fā)布了血液制品排毒/失活的技術(shù)方法和驗(yàn)證指南。顯然需要在生產(chǎn)過程中存在某種病毒去除/滅活能力，并且在生產(chǎn)過程中應(yīng)該有特異性病毒去除/滅活方法。一種有效可靠的病毒滅活/去除方法通常要求病毒滴度≥4病毒滅活/去除后的日志，易于模擬和確認(rèn)。對于工藝條件的變化，為可以最大限度地激活或去除原血漿中可能被污染的病毒，世衛(wèi)組織要求在每種產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中采用兩種或兩種以上的方法對病毒進(jìn)行滅活或去除，才可以有效的確保到了產(chǎn)品的病毒安全。目前的失活技術(shù)包括熱處理（包括巴氏殺菌，干熱，蒸汽加熱），有機(jī)溶劑/表面活性劑（S/D）和低pH培養(yǎng)物。在1948年以來，巴氏殺菌已用于人血清白蛋白產(chǎn)品。到目前為止，已經(jīng)證實(shí)了加工的人血清白蛋白作為無病毒產(chǎn)品，并已寫入世衛(wèi)組織生物制品規(guī)定，但這種方法不適用于凝血因子產(chǎn)品的失活，低pH孵育方法僅適用于免疫球蛋白產(chǎn)品的滅活當(dāng)中。解毒技術(shù)包括沉淀（低溫乙醇），色譜和納米過濾。低溫乙醇方法和色譜法都具有一定的解毒能力。單一應(yīng)用不能完全保證病毒去除，并且需要添加其他特定病毒失活/去除方法。S/D方法首先報道于1985年，是病毒失活/去除方法的第一個飛躍，其被認(rèn)為是消除包膜病毒的絕對有效的方法。1994年報道的納濾方法是病毒失活/去除方法的第二次飛躍。該方法解決了去除甲型肝炎，B19和其他小病毒的問題，但它不適合所有血液制品，并且使用成本相對較高，這限制了該方法的應(yīng)用，并確保了血液產(chǎn)品的病毒安全性。

8 ?結(jié)束語

由上可知，血液制品滅活的方法、原理以及機(jī)制等都存在了一些不同，選擇科學(xué)合理的病毒滅活方法有著十分重要的意義。滅活病毒是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，為能夠有效確保到血液制品的安全性，科學(xué)人員應(yīng)當(dāng)在滅活病毒等方面繼續(xù)的努力前進(jìn)。

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