噻蟲胺在黃瓜葉片中累積量與對溫室白粉虱防治效果的相關性及殘留消解動態(tài)

李清華, 張奇珍, 余曼麗, 尹明明, 李文明*,, 陳福良*,

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，鄭州 450000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京 100193)

溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorumWestwood，屬同翅目粉虱科，具有寄主范圍廣、繁殖能力強、傳播快、為害重及防治難度大等特點。其寄主植物種類繁多，主要為害瓜類、豆科及茄科等作物。黃瓜作為其寄主之一，溫室白粉虱喜食黃瓜嫩葉背面汁液，主要從韌皮部吸食植物汁液，從而造成植株葉面發(fā)黃，影響光合作用，阻礙植物生長，與此同時大量分泌蜜露，污染葉片表面，傳播煤污病等真菌病害及病毒病[1-3]。黃瓜受害后會出現(xiàn)褪綠、變黃、萎蔫等現(xiàn)象，嚴重時導致葉片干枯，甚至植株死亡，嚴重影響品質(zhì)與產(chǎn)量[4-5]。目前，對白粉虱的防治主要以化學藥劑為主，常用的化學藥劑有擬除蟲菊酯類、有機磷類和新煙堿類農(nóng)藥[6-7]，長期使用擬除蟲菊酯類及有機磷類農(nóng)藥，導致白粉虱產(chǎn)生抗性，難以防治。因此，亟須尋找高效替代藥劑。

噻蟲胺 (clothianidin，圖式1) 作為高效安全、高選擇性的新煙堿類殺蟲劑，其靶向作用于煙堿型乙酰膽堿受體，具有高效、廣譜、低毒及使用安全等優(yōu)點[8-9]，因其具有卓越的內(nèi)吸活性，故對溫室白粉虱等刺吸式口器害蟲有良好的防效[10]。噻蟲胺已登記的常規(guī)劑型有：可濕性粉劑、水分散粒劑和懸浮劑等[11]，這些常規(guī)劑型施藥方式大多為莖葉噴霧，與包埋顆粒劑相比，存在降解速率快、防效低及持效期短等問題，需加大用藥量或多次用藥才能達到理想的防治效果，從而增加了對作物與環(huán)境的毒性風險，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

與常規(guī)顆粒劑相比，包埋顆粒劑以具有緩釋作用的低熔點高分子聚合物為載體，在加熱條件下，使農(nóng)藥有效成分在熔融態(tài)載體中熔解并完全被載體包埋，得以緩慢釋放，因此具有較長的持效期[12-13]。18%噻蟲胺包埋顆粒劑以巴西棕櫚蠟和聚乙二醇8 000 為載體，通過將農(nóng)藥有效成分與熔融態(tài)載體均勻混合，再經(jīng)過冷卻、粉碎、過篩等工藝制備而成，其載體屬于可生物降解的高分子聚合物[14-15]，農(nóng)藥有效成分隨著載體的降解緩慢釋放，并在環(huán)境中逐漸降解消失，對環(huán)境友好，符合可持續(xù)發(fā)展理念[16]。

關于噻蟲胺殘留的檢測方法主要有液相色譜法 (LC)[17]、高效液相色譜法 (HPLC)[18-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS/MS)[20-21]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS/MS)[22-23]及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS)[24]等，檢測作物有卷心菜、柑橘、蘋果及韭菜等[25-28]。但尚未見有關黃瓜葉片和土壤中噻蟲胺殘留檢測方法的文獻報道，因此本研究建立了黃瓜葉片和土壤中噻蟲胺殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS)檢測方法。通過溫室黃瓜栽培試驗，以1%噻蟲胺顆粒劑為對照藥劑，研究了18%噻蟲胺包埋顆粒劑在不同施藥量及黃瓜不同生長期條件下，噻蟲胺在土壤中的殘留消解動態(tài)及不同部位葉片中噻蟲胺累積分布情況。進一步探究了黃瓜葉片中的噻蟲胺累積量和對溫室白粉虱防效之間關系，以期為指導其科學施用，降低環(huán)境風險提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 99.0%噻蟲胺 (clothianidin) 標準品，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；供試黃瓜Cucumis sativusL. 品種為‘壽禾中壽35’ (密刺型)，壽光欣欣然園藝有限公司；18%噻蟲胺包埋顆粒劑 (18%clothianidin embedding GR)，中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所研制；1%噻蟲胺顆粒劑 (1% clothianidin GR)，河南省孟州市孟州云大高科生物科技有限公司；色譜純甲酸、N-丙基乙二胺 (PSA) 和十八烷基鍵合硅膠 (C18)，美國Sigma Aldrich 公司；色譜純乙腈，美國Fisher 公司；試驗用水均為超純水。

1.1.2 主要儀器設備 XevoTM TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (UPLC-MS/MS)，美國Waters 公司；BSA224S-CW 電子天平，德國Sartorius 公司；QL-901 渦旋混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore公司；0.22 μm 有機系濾膜，天津市科億隆實驗設備有限公司；2 mL 注射器，江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗地概況 試驗地點設在北京市海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所溫室，于2019 年6—8 月在溫室開展預試驗，正式試驗于2020 年8—10 月進行，試驗地土質(zhì)為壤土，肥力較高，pH 7.2，試驗期間栽培和管理條件良好，肥水管理適中。

1.2.2 試驗設計 參照 《田間藥效試驗準則 (一)殺蟲劑防治溫室白粉虱》[29]中關于溫室白粉虱田間藥效試驗，并嚴格按照以上準則進行。在黃瓜播種的同時，進行藥劑拌土撒施。施藥劑量 (有效成分)：18% 噻蟲胺包埋顆粒劑450 g/hm2(處理1)、600 g/hm2(處理2)、750 g/hm2(處理3)；對照藥劑1%噻蟲胺顆粒劑450 g/hm2(CK1)，空白對照 (CK2)。共5 個處理，試驗小區(qū)采用隨機區(qū)組排列，每處理3 次重復，每重復10 株黃瓜。試驗期間未噴施其他藥劑，所有處理水肥管理一致。

1.2.3 田間防效調(diào)查 調(diào)查白粉虱蟲口數(shù)之前，觀察各處理小區(qū)黃瓜植株生長情況及有無藥害現(xiàn)象產(chǎn)生。調(diào)查時間分別為施藥后21、28、35、42、49、56 和63 d，共調(diào)查7 次。由于本試驗是種植黃瓜的同時采取土壤施藥的方式，而溫室白粉虱是自然發(fā)生，因此以施藥后21 d，即溫室白粉虱形成一定種群數(shù)量時的蟲口數(shù)作為蟲口基數(shù)。在早晨白粉虱不活躍的情況下，采取五點取樣法定點定株調(diào)查，每點調(diào)查2 株，每株黃瓜分別調(diào)查上部和中部各3 片葉，上部葉片為從黃瓜植株根部往上數(shù)第9～11 片葉，中部葉片為從根部往上數(shù)第3～5 片葉。記錄葉片正背面所有白粉虱活蟲蟲口數(shù)。分別按照公式 (1) 和 (2) 計算蟲口減退率與校正防效。

式中：P表示蟲口減退率，%；N0表示施藥前蟲口數(shù) (施藥后21 d 蟲口數(shù))；Nt表示施藥后蟲口數(shù)。C表示校正防效，%；Pt表示處理區(qū)蟲口減退率，%；P0表示空白對照區(qū)蟲口減退率，%。

1.2.4 樣品采集 采用五點取樣法取樣。

土壤樣品：分別于施藥后2 h 及1、3、7、14、21、28、35、42、49、56、63 d 采集土壤樣品，過篩，冷凍干燥后四分法縮分留樣250 g，于-20 ℃保存，待測。

黃瓜葉片樣品：黃瓜葉片樣品采集與白粉虱蟲口數(shù)調(diào)查同期進行，共采集7 次，葉片樣品經(jīng)粉碎勻漿后四分法縮分留樣100 g，于 -20 ℃保存，待測[30]。

1.2.5 樣品前處理 稱取土壤樣品10.00 g (黃瓜葉片樣品5.00 g) 于50 mL 離心管中，依次加入5 mL 超純水 (黃瓜葉片不加水) 和10 mL 乙腈，振蕩10 min，加入1.00 g NaCl 和4.00 g 無水MgSO4，振蕩5 min，于4 000 r/min 下離心5 min；取1.5 mL上清液于2 mL 凈化管 (凈化劑為0.05 g PSA、0.05 g C18和0.15 g 無水MgSO4) 中，渦旋2 min，于8 000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 濾膜至2 mL 進樣瓶，待測。

1.3 儀器檢測條件

色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)，Waters 公司，柱溫35 ℃。流動相為乙腈 (A) 和0.2% 甲酸水溶液(B)，流速0.28 mL/min，進樣量3 μL。流動相梯度洗脫程序：0 min，10%A；＞0～1.0 min，10%A～90%A；＞1.0～1.5 min，90%A；＞1.5～2.0 min，90%A～10%A；＞2.0～2.5 min，10%A。

質(zhì)譜條件：ESI 正離子源模式電離，多反應監(jiān)測模式 (MRM)，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓52 V，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，脫溶劑氣流量500 L/h，錐孔氣流量50 L/h。噻蟲胺在MRM 下的質(zhì)譜采集參數(shù)及質(zhì)譜條件：定性離子對131.90/249.90，定量離子對169.00/249.90。圖1 為質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 噻蟲胺乙腈標準溶液色譜圖，在上述色譜條件下，噻蟲胺的相對保留時間為1.37 min。

1.4 標準溶液配制及標準曲線繪制

稱取0.05 g 噻蟲胺標準品 (精確至0.000 1 g)于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配成1 000 mg/L標準儲備溶液，于4 ℃保存。分別用乙腈梯度稀釋噻蟲胺標準儲備液，配成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 和2 mg/L 的系列噻蟲胺標準溶液。用空白基質(zhì)提取液稀釋，配成同等濃度梯度的噻蟲胺基質(zhì)匹配標準溶液，于4 ℃保存。按1.3 節(jié)的條件測定，以噻蟲胺標準溶液質(zhì)量濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應 (Me) 是指檢測樣品中除分析物以外的組分對分析物分析結(jié)果的準確性造成的影響與干擾，用基質(zhì)標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值表征。當Me值小于0.9 時為基質(zhì)減弱效應；當Me值大于1.1 時為基質(zhì)增強效應；當Me值介于0.9～1.1 時基質(zhì)效應可以忽略[31]。

1.6 添加回收試驗

分別向空白黃瓜葉片樣品和空白土壤樣品中添加0.01、0.1、1 和5 mg/kg 4 個水平的噻蟲胺標準溶液，每個水平重復5 次，靜置2 h 后，按照1.2.5 節(jié)步驟處理樣品，1.3 節(jié)的條件檢測，計算添加回收率及相對標準偏差。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件和Duncan’s 新復極差法進行差異顯著性檢驗 (P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關系、靈敏度與基質(zhì)效應

在0.002～2.00 mg/L 范圍內(nèi)，噻蟲胺標準溶液線性方程為y= 1 138 971x+ 22 190，相關系數(shù)r=0.999 1；噻蟲胺黃瓜葉片基質(zhì)匹配標準溶液線性方程為y= 972168x + 44 449，r= 0.999 9；噻蟲胺土壤基質(zhì)匹配標準溶液線性方程為y= 1 277 158x+103 215，r= 0.998 8。其中，Me(黃瓜葉片) = 0.85，Me(土壤) = 1.12，二者均存在微弱的基質(zhì)效應，故需引入基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。以方法的最低檢測濃度為定量限 (LOQ)，則LOQ 為0.002 mg/L。

2.2 方法的準確度與精密度

結(jié)果 (表1) 表明：在0.01～5 mg/kg 4 個添加水平下，噻蟲胺在黃瓜葉片中平均回收率為95%～96%，相對標準偏差 (RSD) 為0.90%～4.3%；在土壤中平均添加回收率為91%～108%，RSD 為1.3%～4.4%。方法回收率與精密度良好，簡單可行，可滿足農(nóng)藥殘留檢測分析的要求[32]。

表1 噻蟲胺在黃瓜葉片和土壤中的添加回收率與相對標準偏差 (n = 5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of clothianidin in cucumber leaves and soil (n = 5)

2.3 噻蟲胺在土壤中的殘留消解動態(tài)

由表2 可知：噻蟲胺在土壤中的消解動態(tài)符合一級反應動力學方程。噻蟲胺在土壤中的原始沉積量和消解半衰期與施藥劑量呈正相關；同等施藥劑量下，18%噻蟲胺包埋顆粒劑在土壤中的消解速率較對照藥劑緩慢，消解半衰期延長8 d。

表2 噻蟲胺在土壤中的殘留量與消解動態(tài)Table 2 Residues and dissipation dynamic of clothianidin in soil

2.4 噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量

結(jié)果 (圖2) 表明：噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量與施藥劑量呈正相關；隨施藥時間的推移，噻蟲胺在葉片中的累積量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在黃瓜中部葉片中的累積量高于上部葉片，并于施藥后56 d 達到最大值。在同等施藥劑量下，18%噻蟲胺包埋顆粒劑中噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量高出對照藥劑5%～32%，且在施藥后63 d，噻蟲胺在葉片中仍有較高的累積量，從而保證了黃瓜生長后期對溫室白粉虱的防效。

2.5 噻蟲胺對溫室白粉虱的防治效果

結(jié)果 (表3) 表明：試驗期間，噻蟲胺對黃瓜中部葉片溫室白粉虱的防效高于對上部葉片的，且均在施藥后56 d 達到最大值，這與2.4 節(jié)中噻蟲胺在黃瓜中部葉片累積量高于上部葉片的結(jié)果一致。在相同施藥劑量下，18%噻蟲胺包埋顆粒劑對溫室白粉虱的防效顯著高于對照藥劑1%噻蟲胺顆粒劑，防效提高7%～24%；且在施藥后63 d，450 g/hm2處理平均防效為89%，而CK1平均防效僅為66%，表明18%噻蟲胺包埋顆粒劑對黃瓜溫室白粉虱防效高且持效期長。18%噻蟲胺包埋顆粒劑450、600 和750 g/hm23 個施藥劑量之間的防效顯著性分析結(jié)果為：施藥后28～42 d，處理間防效差異顯著；施藥后49～63 d，3 個處理間防效相當，無顯著性差異。其中，在調(diào)查溫室白粉虱蟲口數(shù)前期，18%噻蟲胺包埋顆粒劑對溫室白粉虱的防效表現(xiàn)為低劑量處理高于高劑量，其原因可能是本試驗中的施藥劑量是以大田條件下的推薦施藥劑量為參考，而溫室環(huán)境不同于大田，不同環(huán)境條件下噻蟲胺的消解速率存在顯著差異，而當黃瓜葉片中的噻蟲胺累積量達到一定量時，很難突破防效閾值，導致試驗后期3 個施藥劑量之間防效差異不顯著。

表3 噻蟲胺對溫室白粉虱的防治效果 (n = 5)Table 3 Control efficacy of clothianidin on greenhouse whitefly (n = 5)

2.6 噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量與對溫室白粉虱防效的相關性分析

以18%噻蟲胺包埋顆粒劑有效成分450 g/hm2(處理1) 和1%噻蟲胺顆粒劑450 g/hm2(CK1) 條件下黃瓜上部葉片為例，進行噻蟲胺累積量與防效相關性分析。由圖3 可知：噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量與其對溫室白粉虱的校正防效均隨施藥時間的推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且均在施藥后56 d 達到最大值。在施藥后28～63 d，處理1 對溫室白粉虱的防效為58%～90%，噻蟲胺累積量為1.3～1.9 mg/kg，而CK1防效僅為25%～77%，噻蟲胺累積量為1.2～1.8 mg/kg。在同等施藥劑量條件下，與CK1相比，處理1 對溫室白粉虱的防效提高13%～33%，黃瓜葉片對噻蟲胺的累積量提高0.08～0.30 mg/kg。在施藥后63 d，處理1 防效為85%，CK1僅為62%。

由圖4 可知：18%噻蟲胺包埋顆粒劑施藥劑量為有效成分450 g/hm2(處理1) 時，噻蟲胺對溫室白粉虱的防效隨葉片中噻蟲胺累積量的增加而增大，其防效與累積量的線性相關方程為y=46.70x+ 3.34，相關系數(shù) (r) = 0.910 5，CK1防效與累積量的線性相關性方程為y= 87.95x-90.91，r=0.959 0。

3 結(jié)論與討論

本研究采用UPLC-MS/MS 建立了噻蟲胺黃瓜葉片及土壤中殘留的檢測方法，檢測了噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量與其在土壤中的殘留消解動態(tài)，并通過溫室黃瓜栽培試驗，調(diào)查了18%噻蟲胺包埋顆粒劑對黃瓜溫室白粉虱的防效。結(jié)果表明：在0.01～5 mg/kg 添加水平下，噻蟲胺在黃瓜葉片和土壤中的平均回收率為91%～108%，RSD為0.90%～4.4% (n=5)，方法重復性好，準確度和靈敏度高，可滿足對噻蟲胺殘留檢測的要求。噻蟲胺在葉片中的累積量及在土壤中的殘留量均隨施藥劑量的增加而增加；隨施藥時間的推移，噻蟲胺在葉片中的累積量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，噻蟲胺在土壤中的殘留消解動態(tài)符合一級反應動力學方程。18%噻蟲胺包埋顆粒劑在土壤中的消解半衰期為43～63 d，對照藥劑1%噻蟲胺顆粒劑在土壤中的消解半衰期為35 d。18%噻蟲胺包埋顆粒劑各施藥劑量處理下，對黃瓜溫室白粉虱均表現(xiàn)出良好的防效，其中以450 g a.i./hm2施藥劑量處理黃瓜時的防效最優(yōu)。噻蟲胺在葉片中的累積量與其對溫室白粉虱防效變化趨勢一致，且均在施藥后56 d 達到最高值。

本研究中，18%噻蟲胺包埋顆粒劑在土壤中的消解半衰期為43～63 d。土壤中的農(nóng)藥降解速率與作物生長環(huán)境、施藥方式及土壤類型等多種因素有關[33]。管歡等[34]報道，噻蟲胺在土壤中的消解半衰期為24.3～26.4 d；楊慶喜等[35]研究報道，噻蟲胺在土壤中的消解半衰期為6.5～27.7 d，本研究結(jié)果與之存在顯著差異，其原因可能是：在溫室條件下，由于植株生長空間較為封閉，受自然條件如雨水沖擊、陽光直射等影響較小，因此土壤中的農(nóng)藥降解速率較慢[36-37]。不同土壤類型也會造成農(nóng)藥在土壤中消解速率不同。張鵬等[38]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲胺在北京、貴州和山東土壤中的消解半衰期分別為9.4～21 d、18.7 d 和11.6～15.8 d，噻蟲胺在不同試驗地點土壤中消解半衰期存在差異，其原因可能是土壤中的微生物含量、有機質(zhì)含量、酸堿度、含水量等不同。

隨施藥時間的推移，噻蟲胺在黃瓜葉片中的累積量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與韓毅等[39]對吡蟲啉在煙草植株中吸收傳導分布規(guī)律的研究結(jié)果相似，即在作物根部施藥條件下，煙草葉片中吡蟲啉在施藥后7 d 達到最高含量，隨后開始下降。噻蟲胺在黃瓜中部葉片中的累積量高于上部葉片，其原因可能是噻蟲胺具有強內(nèi)吸活性，通過植株根部吸收、傳導并運輸至葉片部位，中部葉片對噻蟲胺的累積時間較上部葉片長，因此中部葉片對噻蟲胺的累積量高于上部葉片。

本研究結(jié)果表明，當18%噻蟲胺包埋顆粒劑施藥劑量為有效成分450 g/hm2時，即可對溫室白粉虱達到理想的防治效果。黃瓜葉片對噻蟲胺的累積量與對溫室白粉虱防效之間具有良好的相關性，與1%噻蟲胺顆粒劑相比，18%噻蟲胺包埋顆粒劑處理的黃瓜葉片中噻蟲胺累積量較高，且對溫室白粉虱具有較高防效；18%噻蟲胺包埋顆粒劑在土壤中的消解半衰期明顯高于對照藥劑，消解速率緩慢，施藥后63 d 對溫室白粉虱防效仍保持在較高水平，表明其對溫室白粉虱的防治具有較好的持效性。18%噻蟲胺包埋顆粒劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治有害生物時，其農(nóng)藥有效成分釋放速率緩慢，可大幅延長對有害生物防治的持效期，不僅能夠有效地提高農(nóng)藥利用率，而且減少了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中勞動力與財力投入成本，因此具有重要的應用價值和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)指導意義。