基于液相芯片篩查與肝癌相關血清自身抗體的研究

肖 靜，楊 舒，聞 琦，陳子恩，陳嘉童，王徐飛，陳文莉，龍 飛*，彭 濤

(1.廣州醫科大學 基礎醫學院 廣州霍夫曼免疫研究所，呼吸疾病國家重點實驗室，廣東 廣州511436；2.廣東省人民醫院 廣東醫學科學研究所 感染科，廣東 廣州510080)

自身抗體是由于機體內表位擴展、性質改變或隱蔽抗原釋放等原因所產生的針對自身正常組織抗原的相應抗體，其異常表達通常與自身免疫性疾病發生密切相關。近年來，隨著關于病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等患者體內檢測到自身抗體的報道越來越多，自身抗體與肝臟疾病的發生正逐漸成為近年來的一個研究熱點[1-2]。本文利用液相芯片技術制備多重自身抗體液相芯片，對肝炎、肝硬化、肝癌患者以及正常人的臨床血清進行自身抗體檢測分析，篩查與肝癌相關的自身抗體，并對其肝癌診斷的臨床價值進行初步評估，為今后自身抗體作為肝癌輔助診斷標志物提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肝病臨床血清樣本來源于廣東省人民醫院2015年12月到2017年12月份收治的患者，均告知患者研究目的并簽署知情同意書。包括40例肝炎患者，其中男30例，女10例，年齡18-78歲；32例肝硬化患者，其中男25例，女7例，年齡22-75歲；48例肝癌患者，其中男40例，女8例，年齡24-83歲；30例健康體檢者作為正常對照組，其中男19例，女11例，年齡20-84歲。肝癌樣本符合2005版《肝癌診治指南》診斷標準[3]，肝炎、肝硬化符合2005版《病毒性肝炎防治指南》診斷標準[4]。同時收集了南方醫科大學附屬醫院的10例系統性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清樣本驗證方法學，SLE患者均符合1997年美國風濕病學會制定的分類標準[5]。將收集于血清分離管的全血標本室溫放置1 h，然后1000×g離心20 min，取上清分裝至新的EP管中，置于-80℃保存。

1.2 實驗方法

采用Bio-Rad公司液相芯片偶聯試劑盒得到20種自身抗體偶聯微球，用分析液(含1% BSA的PBS溶液)將偶聯微球稀釋混勻至1管，50 μL/孔加入到96孔板，用PBST洗滌2遍。使用樣品稀釋液將臨床血清、質控樣本(人源IgG)以及陰性對照以1∶100 稀釋，50 μL/孔加入到96孔板，37℃避光震蕩1 h，清洗2遍后，加入50 μL/孔生物素標記抗人IgG抗體，37℃避光震蕩0.5 h，清洗2遍再加入50 μL/孔SA-PE，37℃避光震蕩15 min，清洗3遍后重懸微球，Bio-Plex 200液相芯片系統讀取熒光值(MFI)。

為避免非特異吸收信號的干擾，采用特異性結合指數(SBI)評價自身抗體IgG水平：SBI=(待測樣本MFI值-陰性對照MFI值)/(質控樣本MFI值-陰性對照MFI值)[6]。

生化指標包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、采用Beckman coulter AU5821全自動生化分析儀進行測定。甲胎蛋白(AFP)和高爾基蛋白(GP73)采用本實驗室建立的液相芯片聯合檢測GP73和AFP體系進行測定[7]。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 多重自身抗體液相芯片檢測體系驗證

利用SLE臨床血清樣本對所建立的多重自身抗體液相芯片檢測體系進行驗證，結果顯示，Smith、U1-snRNP作為SLE的血清特異性自身抗體，其在SLE組中顯著高于正常對照組。與SLE血清相關的自身抗體，SSA/Ro和La-SSB也表現出在SLE組中顯著高于正常對照組。而Scl-70、Mi-2、tTG、EJ、TPO、LKM-1這些SLE非特異性自身抗體在SLE組和正常對照組中則無顯著性差異。說明所建立的檢測體系結果可靠(表1)。

表1 正常對照組與SLE患者自身抗體IgG表達水平比較分析

2.2 自身抗體在肝炎、肝硬化、肝癌和正常對照組的表達水平比較

肝炎、肝硬化、肝癌組的SSA/Ro、tTG、LC1、PR3、Scl-70、Mi-2、MPO、SSA/Ro以及TIF1-γ自身抗體在肝炎、肝硬化、肝癌組中的表達均顯著高于正常對照組，且肝癌組SSA/Ro顯著高于肝炎和肝硬化組。SP100和P53自身抗體在肝炎、肝癌組中的水平顯著高于正常對照組，且肝癌組中的水平顯著高于肝炎和肝硬化組。U1-snRNP、GP73、P0和Smith自身抗體在肝癌組中表達水平顯著性高于正常對照組以及肝炎和肝硬化組，而肝炎、肝硬化組與正常對照組無顯著性差異。LKM-1、JO-1、EJ自身抗體在肝癌組的水平顯著高于正常對照組，而在肝炎和肝硬化組中與正常對照組、肝癌組相比均無顯著性表達差異。La-SSB、TPO、AFP自身抗體在肝炎、肝硬化和肝癌中的水平與正常對照組間無顯著性差異(表2)。

表2 正常對照組與肝炎、肝硬化和肝癌患者各自身抗體IgG水平比較分析

2.3 自身抗體對肝癌的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示，SSA/Ro、tTG、LC1、PR3、Scl-70、Mi-2、SP100的ROC自身抗體診斷肝癌的曲線下面積優于AFP，其中tTG的靈敏度和特異性最高(表3)。

表3 自身抗體對肝癌的診斷效率

2.4 肝癌相關自身抗體與生化指標相關性分析

結果顯示，肝癌相關自身抗體之間呈顯著正相關，生化指標之間GGT與ALT、AST、GP73呈顯著正相關；ALT與AST顯著正相關；AST與ALB顯著負相關；GP73與AFP顯著正相關；而自身抗體與生化指標之間無顯著相關性(表4)。

表4 肝癌相關自身抗體與生化指標的Spearman相關性分析

3 討論

目前認為持續的炎癥反應、免疫失調是肝癌發生發展的關鍵病理機制之一[8]，肝癌的發生通常與病毒性肝炎、肝硬化、環境因素等密切相關。隨著越來越多報道，一些慢性肝炎、肝癌患者血清中有異常的自身抗體表達，認為肝病與自身免疫反應密切相關[9-10]。研究認為HCV感染會導致機體內免疫調節系統紊亂可能破壞Ro蛋白等自身抗原的存在環境，從而引起SSA/Ro、Mi-2和Scl-70等ENA自身抗體大量產生[11]，并且隨著肝炎病情進展，ENA抗體陽性率可能持續升高[12]，這與本研究抗SSA/Ro在肝癌中的水平顯著高于肝炎和肝硬化結果一致，提示SSA/Ro異常表達可能與肝癌的發展進程有關。此外，病毒性肝炎可伴發周圍神經病變，肝外表現可能與血管炎等有關[13]，進而可能引起血管炎相關的PR3和MPO等自身抗體異常表達。抗LC1通常被認為是自身免疫性肝炎的標志物。有研究認為抗LC1陽性提示AIH患者可能伴隨有其他自身免疫性疾病、重癥肝炎或肝硬化等[14]。抗SP100自身抗體作為原發性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體，其在肝癌組的水平顯著高于正常對照及肝炎和肝硬化組，顯示其在肝癌鑒別診斷方面的潛能。此外，值得注意的是本研究發現作為特異性血清抗體被用于乳糜瀉大規模高危人群篩查的tTG自身抗體對肝癌診斷的靈敏度和特異度均很高，表現出良好的肝癌診斷潛在價值。乳糜瀉可合并自身免疫性肝病，常伴發肝臟損傷，因此在慢性肝炎、自身免疫性疾病等多種疾病中均有一定抗tTG抗體陽性率[15-16]。

此外，相關性結果顯示自身抗體之間呈顯著正相關，說明在肝癌的發展進程中，通常存在多種自身抗體異常表達的情況，這可能與肝癌發展進程有關。在我國，約70%的肝癌是由病毒感染引起的病毒性肝炎發展為肝硬化、肝癌，這不僅發生肝臟的免疫病理損傷，還可誘發多種肝外自身免疫現象，引起免疫系統紊亂[17]。而自身抗體與生化指標之間無顯著相關性則提示肝癌發展進程中所引起的肝損傷和肝外系統損傷可能是由不同機制所致，但其具體機制和臨床意義有待進一步研究。

綜上所述，本研究利用自身抗體多重檢測液相芯片體系，篩選到SSA/Ro、tTG、LC1、PR3、Scl-70、Mi-2和SP100自身抗體在肝炎、肝硬化、肝癌中存在異常表達。這提示在肝癌的發展進程中不僅引起肝功能損傷，還引起患者機體免疫調節系統紊亂，進而導致多種自身免疫抗體水平異常表達。臨床上自身抗體的檢測有助于了解肝病患者病情狀況，自身抗體異常表達提示需積極預防肝癌的發生。當然本研究存在一定局限性，如樣本例數偏少,樣本類型不多等，后續還需進一步擴大驗證。