液質(zhì)聯(lián)用方法用于多發(fā)性硬化的血漿蛋白質(zhì)組標(biāo)志物研究

楊雯棋，吳紹長(zhǎng)，周大金，章麗娟，閆秀梅，何成彥，何 平，孫景春*，趙龍友

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.浙江省麗水市第二人民醫(yī)院 a.老年醫(yī)學(xué)科； b.檢驗(yàn)科；c.臨床實(shí)驗(yàn)室，浙江 麗水323000)

多發(fā)性硬化(MS)是一種免疫介導(dǎo)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS),以炎癥反應(yīng)、脫髓鞘、突觸病變、少突膠質(zhì)細(xì)胞喪失和反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生等為主要病理特征[1]。MS目前的發(fā)病機(jī)制是動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的。在同一MS亞型中，也能觀察到不同的疾病進(jìn)展情況[2]。并且，由于目前缺乏特異性早期診斷指標(biāo)，許多患者無(wú)法在早期進(jìn)行診斷，延誤了疾病的治療。為了早期識(shí)別疾病和提供更具體化的治療方法，需要尋找有助于疾病早期診斷的生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠找到疾病相關(guān)差異蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)功能分析可以闡明疾病機(jī)理，能為MS提示重要的相關(guān)通路，同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)用于MS診斷的生物標(biāo)記物[3]。在目前的研究中，對(duì)體液中MS生物標(biāo)志物的研究已有一些蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)結(jié)果。Maria L等人使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腦脊液中鑒定了8個(gè)MS亞型相關(guān)蛋白，其中載脂蛋白C-I、載脂蛋白A-II、augurin、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶和胰蛋白酶-1均上調(diào)[4]。Jesse H等人通過(guò)蛋白質(zhì)組方法分析研究了MS的腦脊液，尋找相關(guān)蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，確定了一些潛在的生物標(biāo)記物，可以用于區(qū)分多發(fā)性硬化癥與健康對(duì)照和其他神經(jīng)疾病，但還需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證其臨床應(yīng)用的能力[5]。并且，目前MS生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)主要集中在腦脊液上，血漿蛋白質(zhì)組的研究還有待于進(jìn)一步加強(qiáng)。在過(guò)去的幾年里，色譜質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)、蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)和生物信息學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展，廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。因此，本研究使用高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)來(lái)研究MS血漿蛋白質(zhì)組，用于尋找相關(guān)的蛋白質(zhì)診斷標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

實(shí)驗(yàn)組患者符合 McDonald的 MS確診標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組系健康志愿者，經(jīng)患者(家屬)和健康志愿者知情同意后,靜脈抽全血3 ml置于無(wú)菌的玻璃試管,靜置 30 min后,高速低溫離心 15 min,收集上清液,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、尿素、硫脲、鹽酸胍(Sigma-Aldrich 公司);胰蛋白酶(質(zhì)譜級(jí))(Promega 公司);乙腈、甲酸、乙醇、碳酸氫銨均為色譜級(jí)(Merk 公司);去除蛋白試劑盒、液相色譜、質(zhì)譜儀(Thermo公司)

1.3 方法

1.3.1血漿蛋白的提取和酶切 去除血漿中高豐度蛋白，根據(jù)去除蛋白試劑盒(Thermo公司)說(shuō)明書操作。應(yīng)用BCA試劑盒對(duì)去除高豐度后的蛋白進(jìn)行定量。取50 μg待測(cè)樣品用(8 mol鹽酸胍，50 mmolPBS)溶液變性。加入1 mol的DTT溶液，37℃靜置1小時(shí)。加入1 mol的碘乙酰胺溶液。30℃，避光30 min。樣本轉(zhuǎn)移到 10 kd超濾膜上用緩沖液(7 mol/L尿素和50 mmol/L Tris) 清洗兩次之后，用100 mM三乙基碳酸氫銨溶液再清洗兩次。處理后的樣品在100 mM三乙基碳酸氫銨溶液中用胰蛋白酶消化，37℃過(guò)夜。將超濾管4℃ 12 000×g/min 離心20 min，收集酶解產(chǎn)物。混勻樣品肽段保存于-20℃冰箱。

1.3.2TMT定量標(biāo)記 樣品加入200 μl 超純水、20 μl TMT 標(biāo)記試劑，離心后室溫靜置1 h。加入4 μl 5%羥胺，終止反應(yīng)15 min。真空抽干樣品后冷凍保存待用。

1.3.3色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析 多肽樣品采用C18反相分析柱(50 mm×15 cm×3 μm)進(jìn)行分離，液相的洗脫液梯度為 2%-100% B液(0.1%甲酸，80%乙腈)，洗脫時(shí)間為120 min。分析采用數(shù)據(jù)依賴性掃描模式，在Top20個(gè)母離子通過(guò)高能量碰撞(HCD)打碎，標(biāo)準(zhǔn)化(NCE)為30。子離子分辨率3500(AGC 2.2e4)。全掃描和MS/MS最大填充時(shí)間分別設(shè)置為50 ms和45 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30 s。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4.1定性分析 利用Proteome Discovery 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

1.4.2生物信息學(xué)分析 用SIMCA軟件對(duì)蛋白進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，用 IPA(Ingenuity Pathway Analysis)軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 血漿蛋白質(zhì)組的分析

在MS疾病組和健康對(duì)照組共18個(gè)血漿樣品中鑒定出541種蛋白質(zhì)，將兩組共同定量到的229個(gè)蛋白質(zhì)做 PCA分析，PCA結(jié)果表明MS疾病組(p)和健康對(duì)照組(c)之間的血漿蛋白質(zhì)組表現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)(圖1)。

圖1 血漿蛋白質(zhì)組主成分分析 圖2 血漿差異蛋白火山圖

對(duì)MS疾病組和對(duì)照組進(jìn)行血漿差異蛋白分析。根據(jù)P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到差異蛋白質(zhì)52個(gè)，其中27個(gè)為上調(diào)蛋白，25 個(gè)為下調(diào)蛋白(圖2)。

2.2 血漿差異蛋白的生物信息學(xué)分析

IPA功能分析表明，MS相關(guān)的差異蛋白參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)/相互作用和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展等功能(圖3)。傳導(dǎo)通路分析表明，這些蛋白主要富集于免疫/炎癥途徑(原發(fā)性免疫缺陷信號(hào)、急性期反應(yīng)信號(hào)、補(bǔ)體系統(tǒng)、B細(xì)胞信號(hào)通路、巨噬細(xì)胞信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)、LXR/RXR激活、FXR/RXR激活、吞噬作用等)、凝血相關(guān)途徑(凝血系統(tǒng)、內(nèi)在凝血酶原激活途徑、外在凝血酶原激活途徑、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路)(圖4)。

圖3 血漿差異蛋白功能分析 圖4 血漿差異蛋白途徑分析

2.3 血漿差異蛋白的受試者工作特征(ROC)分析通過(guò)ROC分析MS疾病組與健康對(duì)照組差異蛋白的關(guān)系，共找到17個(gè)蛋白(表1)的AUC。曲線下面積超過(guò)0.9，這些蛋白有可能成為MS診斷的血漿蛋白標(biāo)志物。

表1 MS疾病組和健康對(duì)照組17個(gè)差異蛋白

3 討論

本研究通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用方法分析了血漿蛋白質(zhì)組，共發(fā)現(xiàn)了57個(gè)MS診斷相關(guān)的差異蛋白，這些差異蛋白主要富集于免疫與炎癥相關(guān)通路(補(bǔ)體系統(tǒng)、巨噬細(xì)胞信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷信號(hào)通路、B細(xì)胞信號(hào)通路、星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)展、LXR/RXR激活、急性期反應(yīng)信號(hào)、FXR/RXR激活等)。其中，補(bǔ)體系統(tǒng)在整個(gè)生命過(guò)程中可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和再生。補(bǔ)體通路的過(guò)度激活可導(dǎo)致許多神經(jīng)炎癥疾病的發(fā)生，如視神經(jīng)脊髓炎(NMO)、阿爾茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)等。最近的一項(xiàng)研究表明，補(bǔ)體沉積在MS大腦的突觸上，并且在MS的動(dòng)物模型(EAE)中，抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)可以防止突觸喪失[6]。其次，巨噬細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞是多發(fā)性硬化病理變化最突出的先天貢獻(xiàn)者，主要負(fù)責(zé)髓鞘的損傷和清除，這是多發(fā)性硬化病變的標(biāo)志[7]。此外，差異蛋白也參與凝血相關(guān)通路(凝血系統(tǒng)、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)、內(nèi)在凝血酶原激活、外在凝血酶原通路)。有研究表明血漿凝血系統(tǒng)對(duì)MS疾病進(jìn)展的嚴(yán)重程度有重要貢獻(xiàn)[8]。在多發(fā)性硬化癥患者中，幾種凝血因子的失調(diào)均被證實(shí)，如F12、F1等[9]，提示凝血可能是MS的重要功能途徑之一。

通過(guò)去差異蛋白進(jìn)行ROC分析，找到了17種具有臨床應(yīng)用潛力的蛋白，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)具有良好的應(yīng)用潛力。

IGFBP-2的主要功能是將IGF-1轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的組織和細(xì)胞中，IGF-1不僅是一種有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)因子，而且是一種少突膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，具有強(qiáng)大的髓鞘生成能力。以往研究表明，MS中IGFBP-2的上調(diào)可能會(huì)將IGF-1靶向到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中，引發(fā)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞支持因子或提供一個(gè)有利的結(jié)構(gòu)環(huán)境，從而輔助多發(fā)性硬化的自發(fā)再髓鞘發(fā)生[10]。本研究通過(guò)差異蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)IGFBP-2參與的胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)信號(hào)通路得到富集，說(shuō)明IGFBP-2可以反映MS疾病的變化，有可能成為MS潛在的血漿標(biāo)志物。

HGF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種多功能蛋白，具有重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能。在以往的研究顯示，HGF與MS疾病相關(guān)。在神經(jīng)元特異性過(guò)表達(dá)HGF的轉(zhuǎn)基因EAE小鼠或接受外源性HGF供應(yīng)的EAE小鼠中，神經(jīng)炎癥和脫髓鞘的嚴(yán)重程度顯著降低[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)HGF水平升高，這可能是MS疾病相關(guān)炎癥導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，從而導(dǎo)致的機(jī)體的一種代償效應(yīng)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，HGF參與的調(diào)控通路白細(xì)胞介素-7、上皮細(xì)胞的重塑連接、巨噬細(xì)胞的信號(hào)通路等均得到了富集，與以往的研究相一致，說(shuō)明HGF在MS發(fā)病過(guò)程中有重要作用，其可能是治療MS疾病的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物。

總之，本研究利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，研究了多發(fā)性硬化患者組和健康對(duì)照組的血漿蛋白質(zhì)組。發(fā)現(xiàn)了一些有可能用于區(qū)分MS疾病組和健康對(duì)照組的血漿標(biāo)志物，這為MS的早期診斷提供了線索，為未來(lái)MS疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。