TRIM59激活β-catenin/TCF4信號通路促進骨肉瘤細胞的侵襲和遷移

祝開忠，陳濤，陳煥雄，王挺銳，鐘貞浩

骨肉瘤是臨床上常見的惡性骨腫瘤之一，也是兒童腫瘤的主要類型之一，約占兒童所有惡性腫瘤的2.4%，約占所有原發性骨腫瘤的20%[1-3]。骨肉瘤是一種發生在骨骼中的疾病，其特征為異常生長和轉移，主要表現為關節疼痛和疲勞等特征性癥狀。當前治療這種惡性腫瘤的一個困難是骨肉瘤對傳統化療的耐藥性[4-6]。盡管非轉移性骨肉瘤的診斷和治療有所改善，但轉移患者的預后較差，5 年患者生存率低于20%[7]。因此，闡明骨肉瘤轉移的機制尤為重要，以確定新的有效的靶向治療，可能對提高骨肉瘤患者的總生存率具有重要作用。

三結構域（tripartite motif，TRIM）家族有超過70 多個成員，其中大部分蛋白屬于E3 泛素連接酶，其共同特征是具有鋅指結構域（RING）。這些蛋白參與了多種復雜的生物學過程，主要包括基因轉錄調控、細胞膜修復、細胞骨架重塑和腫瘤的生長及轉移等[8]。TRIM 家族成員中包括TRIM13、TRIM19 和TRIM25 等，已被證明在白血病、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤發生過程中，通過轉錄因子的調節而發揮生物學活性[9-10]。TRIM59 作為一種表面分子，研究已經證明其與較多腫瘤的進展相關，其致癌特征于2011 年首次被研究者發現并報道[11]。此外，TRIM59 也已被確定為人類腫瘤發生過程中的生物標志物之一，主要包括乳腺癌[12]、肺癌[13]和膀胱癌[14]等。研究表明，TRIM59 的生物學活性與p53 的調控密切相關，TRIM59 與p53 作用使其發生泛素化降解從而促進腫瘤的生長和遷移[15]。此外，在轉基因的前列腺癌小鼠模型中，觀察到TRIM59 通過與Ras信號通路的相互作用而發揮其原癌基因功能[16]。然而，TRIM59 在人類骨肉瘤中的確切作用仍有待進一步予以闡明。β-catenin 信號通路在腫瘤的發生過程中起著關鍵性的作用，研究也證明了骨肉瘤中異常激活的β-catenin 信號通路與骨肉瘤的轉移密切相關[17]，然而其異常激活機制尚有待進一步予以研究闡釋。

本研究首先證實了TRIM59 在骨肉瘤組織及細胞中高表達，下調骨肉瘤細胞中TRIM59 的表達后，其侵襲及遷移能力明顯減弱；在機制方面，本研究證實了TRIM59 通過激活β-連環蛋白（β-catenin）/轉錄因子4（transcription factor 4，TCF4）信號通路，進而影響骨肉瘤的侵襲及遷移。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2015 年1 月—2019 年12 月由海南醫學院第一附屬醫院收治的53 例骨肉瘤患者的腫瘤組織及其相應的非腫瘤組織（所有非腫瘤組織距離腫瘤邊緣＞3 cm）標本。所有標本都經過病理醫生診斷，且所有患者術前均未接受化療，切除的新鮮組織立即放置于液氮中儲存。本研究經過海南醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審批同意，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 細胞、試劑和儀器

骨肉瘤細胞U2-OS、MG-63、143B 及正常成骨細胞hFOB1.19 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；所有的細胞均培養于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 培養液中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中進行。所有細胞實驗均培養6 代以后使用。

FBS 及DMEM 培養液購自美國BI 公司。兔抗人TRIM59、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-catenin 和重組人TCF4 單克隆抗體，鼠抗人GAPDH（內參照）單克隆抗體，以及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG 均購自英國Abcam公司。TRIM59-shRNA（shTRIM59）重組質粒及其陰性對照（negative control，NC）-shRNA（shNC）重組質粒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；shTRIM59 序列為5’-ACATTACAGGCAACCATTAAA-3’，shNC 序列為5’-AACAGTCGCGTTTGCGA CTGC-3’。轉染試劑LipofectAMINE 3000 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，反轉錄試劑 盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser）和實時熒光定量PCR 試劑盒（TB Green Premix Ex Taq）均購自日本TaKaRa 公司。TRIM59 及GAPDH基因引物由廣州銳博生物科技有限公司合成；TRIM59基因上游引物序列為5’-GGCTCTCTGTGATGTTGGVA-3’，下游引物序列為5’-TTCAAGCTGCTCTCGTA-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-CCTGCCG GTGACTAACCCTG-3’，下游引物序列為5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3’。

實時熒光定量PCR 擴增儀為美國Bio-Rad公司產品，光學顯微鏡為美國Thermo Scientific公司產品。

1.3 實驗動物

裸鼠（ALB/c-nu/nu、雄性、5 周齡、體質量為15～20 g）購自湖南斯萊克斯景達實驗動物有限公司[SCXK（湘）：2019-0004]。均飼養于無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級實驗室。

1.4 蛋白質印跡法檢測

收集骨肉瘤細胞和手術獲得的骨肉瘤組織標本30 例，加入RIPA 裂解液裂解細胞，組織則先行勻漿處理，再加入RIPA 裂解液裂解組織細胞；加 入PMSF 處理后，12 000×g離心10 min 收集上清液，采用BCA 法對蛋白進行定量。每組樣品取40 μg 蛋白加入蛋白質緩沖液沸水浴處理10 min 使其變性后上樣，行10% SDS-PAGE 分離蛋白；將分離后的蛋白轉移至PVDF 膜上，用含5% 脫脂牛奶的封閉液封閉處理1 h 后，加入一抗[兔抗人TRIM59 單克隆抗體和鼠抗人GAPDH（內參照）單克隆抗體（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）] 4 ℃孵育過夜，經TBST 洗膜3 次后加入HRP 標記的山羊抗鼠IgG 或山羊抗兔IgG 室溫孵育1 h，滴加電化學發光試劑，待顯影后拍照保存并分析檢測結果。

1.5 實時熒光定量PCR 法檢測

收集骨肉瘤細胞和手術獲得的骨肉瘤組織標本30 例。用TRIzol 試劑裂解細胞和均漿處理后的組織，提取細胞和組織中的總RNA。采用反轉錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser）將RNA 反轉錄為cDNA 后，并進一步用實時熒光定量PCR 試劑盒（TB Green Premix Ex Taq）進行下一步PCR 擴增。PCR 反應條件為預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環；引物序列見1.2 節。以2-ΔΔCt值表示各目的基因的相對表達水平。

1.6 免疫組織化學檢測

新鮮的骨肉瘤及其相應的非癌組織30 對經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后進行切片厚度為4 μm，將切片置于65 ℃的烤箱中烘烤3 h；進行脫蠟和水化后，滴加含5%牛血清白蛋白的封閉液室溫封閉30 min；加入適量的一抗[兔抗人TRIM59 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶150）]4 ℃反應過夜。滴加相應的生物素標記的二抗（工作液體積稀釋比例為1 ∶2 000）室溫孵育1 h，最后滴加HRP 標記的鏈親和素，經DAB 顯色后在光學顯微鏡下觀察染色情況（放大倍數為200倍）。TRIM59 主要表達于細胞質中；根據染色強度和陽性細胞在總細胞中所占的百分比判定陽性強度，弱陽性（＋）為3 分，中陽性（＋＋）為6 分，強陽性（＋＋＋）為9 分。

1.7 構建TRIM59 基因沉默表達的骨肉瘤細胞

采用病毒感染的方法將攜帶有特異性針對TRIM59 基因的shRNA（shTRIM59）或陰性對照shRNA（shNC）的重組質粒轉入骨肉瘤U2-OS 細胞；并進一步采用實時熒光定量PCR法（檢測流程同1.5 節）和蛋白質印跡法（檢測流程同1.4 節）檢測感染效率。

1.8 Transwell 小室實驗

采用基質膠包被（每孔約50 μL，靜置30 min）Transwell 小室。將TRIM59 基因沉默表達的U2-OS 細胞以及對照組細胞接種于培養板中，于細胞培養箱中培養24～36 h 后，采用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，收集細胞經清洗后重懸細胞。計數后按2×104個/孔的密度接種于小室的上室中（每組設置3 個復孔）；繼續培養48 h，取出小室并小心將未穿過小室膜的細胞拭去，用PBS 清洗后加入甲醇溶液固定細胞20 min，待細胞固定后加入0.1%結晶紫進行染色，于光學顯微鏡下（放大倍數為100 倍）觀察細胞染色情況及形態（每組細胞觀察4 個視野）并計數。

1.9 劃痕愈合實驗

將TRIM59 基因沉默表達的U2-OS 細胞以及對照組細胞接種于培養皿中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養至細胞鋪滿培養皿底部約80%～90%時，采用相同大小的槍頭（如200 μL）進行劃痕處理（務必保證每孔劃痕粗細均勻）；用PBS 清洗脫落下來的細胞，并加入不含血清的培養液于培養箱中繼續培養24 h 后，在倒置光學顯微鏡下（放大倍數為100 倍）觀察劃痕愈合情況，并拍照記錄和分析愈合率。

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1.10 蛋白質印跡法檢測沉默TRIM59 基因表達對骨肉瘤細胞中上皮-間質轉化相關蛋白表達的影響

收集TRIM59 基因沉默表達的U2-OS 細胞以及對照組細胞，采用蛋白質印跡法檢測U2-OS細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 蛋白的表達水平，檢測流程同1.4 節。一抗分別為兔抗人E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 單克隆抗體，以GAPDH 為內參照。

1.11 沉默TRIM59 基因表達對骨肉瘤細胞在小鼠肺轉移中的影響

收集TRIM59 基因沉默表達的U2-OS 細胞以及對照組U2-OS 細胞，經胰蛋白酶消化計數后將細胞密度調整為1×107個/mL。每組6 只小鼠，每只裸鼠通過尾靜脈注射100 μL 骨肉瘤細胞懸液；于SPF 級別的環境下進行飼養，4 周后將各組裸鼠通過安樂死的方法處死，取出裸鼠肺臟，石蠟包埋后行HE 染色檢測雙肺是否存在轉移腫瘤。

1.12 TRIM59 對骨肉瘤細胞中β-catenin/TCF4信號通路活性的影響

首先采用蛋白質印跡法檢測TRIM59 基因沉默表達的U2-OS 細胞以及對照組U2-OS 細胞中β-catenin/TCF4 信號通路相關蛋白β-catenin 和TCF4 的表達水平，檢測流程同1.4 節。一抗分別為兔抗人β-catenin 和重組人TCF4 單克隆抗體，以GAPDH 為內參照。

隨后，收集骨肉瘤143B 細胞，采用病毒感染的方法將TRIM59 過表達（overexpression，OE）重組質粒及對照空載體（Vector）轉入細胞，然后采用β-catenin 信號通路抑制劑XAV939（10 μmol/L）處理TRIM59 過表達的143B 細胞24 h。采用蛋白質印跡法檢測3 組細胞中β-catenin和TCF4 蛋白的表達水平。

最后，使用Transwell 小室及劃痕愈合實驗檢測TRIM59 過表達和XAV939 抑制β-catenin/TCF4 信號通路活性后，143B 細胞侵襲（檢測流程同1.8 節）及遷移（檢測流程同1.9 節）能力的變化情況。

1.13 統計學方法

采用SPSS 26.0 及Prism 7 統計軟件對所有的研究數據進行統計分析。癌及癌旁組織比較采用配對樣本t檢驗；所有的實驗均獨立重復3 次，數據用表示，多組均數之間的比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織及細胞中TRIM59 的表達升高

為闡明TRIM59 在骨肉瘤中的表達水平及作用，本研究首先檢測30 例人骨肉瘤組織及其癌旁正常組織中TRIM59 蛋白的表達水平。蛋白質印跡法檢測結果（圖1A）顯示，30 例骨肉瘤組織中23 例TRIM59 蛋白的表達水平明顯高于相應的癌旁組織（P＜0.01），7 例癌組織中TRIM59蛋白的表達水平與癌旁組織無明顯差異。圖1A展示了6 例具有代表性的TRIM59 蛋白表達水平較高的病例。

進一步采用免疫組織化學法檢測了30 例骨肉瘤組織中TRIM59 蛋白的表達水平。結果（圖1C）同樣表明也證實了TRIM59 的表達明顯高于相應的癌旁組織，其中腫瘤組織中TRIM59 的陽性率為76.67%（23/30），而癌旁組織中陽性率僅為16.67%（5/30）。

進一步通過實時熒光定量PCR 法（圖1D）及蛋白質印跡法（圖1E）證實了，骨肉瘤U2-OS、MG-63 及143B 細胞中TRIM59 mRNA（P＜0.05）及蛋白的表達水平均明顯高于正常成骨細胞hFOB1.19。上述結果表明，TRIM59 在骨肉瘤細胞及組織中表達升高。

Fig.1 The expression level of tripartite motif family protein 59 (TRIM59) in osteosarcoma tissues and cells were up-regulated.A: Western blotting was used to detect the expression level of TRIM59 protein in tumor tissues (T) and adjacent-carcinoma tissues (N) (The TRIM59 protein expression level in six typical osteosarcoma tissues and adjacent-cancerous tissues was displayed) (**P＜0.01).B: The expression level of TRIM59 mRNA in osteosarcoma tissues was significantly higher than that in para-carcinoma tissues(**P＜0.01).C: The expression level of TRIM59 protein was detected by immunohistochemistry (IHC) (DAB staining,×100) (**P＜0.01).D and E: Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect TRIM59 mRNA and protein expression levels in osteosarcoma U2-OS,MG-63,143B cells and normal osteoblast hFOB1.19 cells (as the control) [△P＜0.05,△△P＜0.05,the control group (n=3)].圖1 分別采用蛋白質印跡法、實時熒光定量PCR 法及免疫組織化學法檢測30 例骨肉瘤組織及其癌旁組織（A～C）以及骨肉瘤細胞中TRIM59 mRNA 和蛋白的表達水平（D～E）

2.2 下調骨肉瘤細胞中TRIM59 的表達水平后能抑制骨肉瘤細胞的侵襲及遷移能力

骨肉瘤的一個重要特征是其具有較高的轉移性，最近研究也證實了肺癌及胃癌中TRIM59 的表達與腫瘤的轉移密切相關。為了檢測TRIM59是否同樣影響骨肉瘤的轉移，本研究中采用病毒感染的方法將攜帶有shTRIM59 的重組質粒轉入骨肉瘤U2-OS 細胞，并采用實時熒光定量PCR 及蛋白質印跡法驗證其轉染效率，結果提示TRIM59 mRNA（圖2A）及蛋白（圖2B）的表達水平均較對照組明顯下調（P均＜0.01）。

隨后采用Transwell 小室實驗和劃痕愈合實驗檢測了沉默TRIM59 表達對骨肉瘤細胞侵襲及遷移能力的影響。結果顯示，TRIM59 表達下調后U2-OS 細胞的侵襲（圖2C）和遷移（圖2D）能力均明顯降低（P均＜0.01）。

進一步采用蛋白質印跡法檢測了沉默TRIM59 表達對骨肉瘤U2-OS 細胞中上皮-間質轉化相關蛋白E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 表達水平的影響，結果（圖2E）顯示，TRIM59 表達下調后U2-OS 細胞中N-cadherin和Vimentin 蛋白的表達水平明顯下調（P均＜0.05），而E-cadherin 蛋白的表達水平明顯上調（P＜0.05）。

對小鼠肺組織的HE 染色結果（圖2F）顯示，尾靜脈注射骨肉瘤U2-OS/shNC 和U2-OS/shTRIM59 細胞后，對照組6 只小鼠中5 只發生肺轉移，shTRIM59 組6 只小鼠中僅有1 只發生肺轉移。以上結果表明，下調骨肉瘤細胞中TRIM59的表達水平后其體內外轉移的能力明顯減弱。

Fig.2 Effect of down-regulation of tripartite motif family protein 59 (TRIM59) expression level on invasion and migration abilities of osteosarcoma U2-OS cells and its possible mechanism.A-B: Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to verify the expression levels of TRIM59 protein and mRNA in U2-OS cells transfected with shTRIM59.C-D: After down-regulated the expression level of TRIM59 in osteosarcoma U2-OS cells,Transwell assay and Wound healing experiment were used to detect its invasion and migration abilities.E: Western blottign was used to detect the expression level of epithelialmesenchymal transition (EMT)-related proteins (N-cadherin,E-cadherin and Vimentin).F: HE staining result of lung tissues in six mice (tail vein injection of shNC/U2-OS or shTRIM59/U2-OS cells).U2-OS cells were transfected with shNC.*P＜0.05,**P＜0.01,vs shNC group (n=3).圖2 下調TRIM59 表達水平對骨肉瘤U2-OS 細胞侵襲及遷移能力的影響及可能的作用機制

2.3 TRIM59 通過激活β-catenin 信號通路影響骨肉瘤細胞的侵襲及遷移

有研究報道，Wnt/β-catenin 信號通路活化是一個重要的致癌過程，在腫瘤的發生及發展中起著關鍵性作用[18]。蛋白質印跡法檢測結果（圖3A）顯示，下調骨肉瘤U2-OS 細胞中TRIM59 蛋白的表達水平后，β-catenin 和TCF4 蛋白的表達水平均明顯下調（P均＜0.05）；這一結果提示下調TRIM59 表達后β-catenin/TCF4 信號通路明顯被抑制。

本研究中進一步將攜帶有TRIM59 基因的重組過表達載體轉入骨肉瘤143B 細胞中，然后采用β-catenin 信號通路抑制劑XAV939（10 μmol/L）處理24 h。蛋白質印跡法檢測結果（圖3B）表明，上調TRIM59 表達后，β-catenin 信號通路相關蛋白β-catenin 和TCF4 的表達水平均明顯上調（P均＜0.05），但在加入XAV939 抑制劑后，激活的β-catenin 信號通路相關蛋白均恢復表達水平，即表達水平下調（P均＜0.05）。最后通過Transwell 小室（圖3C）及劃痕愈合實驗（圖3D）表明，上調TRIM59 表達后骨肉瘤細胞的侵襲及遷移能力明顯增強（P均＜0.05），而加入XAV939 抑制劑后，其侵襲及遷移能力恢復（P均＜0.05）。上述結果表明，TRIM59 可能通過激活β-catenin/TCF 信號通路進而影響骨肉瘤的侵襲及遷移。

Fig.3 Tripartite motif family protein 59 (TRIM59) affects the invasion and migration of osteosarcoma by activating β-catenin signaling pathway.A: The expression levels of TRIM59,β-catenin and transcription factor 4 (TCF4) proteins in osteosarcoma U2-OS cells transfected with shTRIM59 were detected by Western blotting.U2-OS cells were transfected with shNC as the control.B: The expression levels of TRIM59,β-catenin and TCF4 proteins in osteosarcoma 143B cells treated with TRIM59 overexpression(OE) recombinant plasmid (OE-TRIM59) or OE-TRIM59 combined with inhibitor XAV939 (10 μmol/L)were detected by Western blotting.C-D: Transwell assay and Wound healing experiment were used to detect invasion and migration abilities of 143B cells treated with OE-TRIM59 or OE-TRIM59 combined with inhibitor XAV939.143B cells were treated with empty vector as the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).圖3 TRIM59 通過激活β-catenin 信號通路促進骨肉瘤細胞的侵襲及遷移

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性腫瘤之一，據報道，美國每年有接近三分之一的骨肉瘤患者死亡，其中大多數是青少年，其主要原因是其惡性程度高，發現早期易發生肺部轉移等[19-20]。因此，亟需進一步的研究來幫助發現新的診斷和預后生物標志物，以及更好地理解和掌握骨肉瘤發展的機制。

近年來，越來越多的修剪蛋白被研究者密切關注，據報道其對人類癌癥的進展至關重要。例如，TRIM44和TRIM26的表達被研究者發現與肝癌患者的生存期密切相關[21-22]；TRIM29在膀胱癌中高表達且與預后密切相關，細胞中下調膀胱癌細胞中TRIM29的表達后期侵襲及遷移能力明顯減弱[23]。研究還表明在乳腺癌細胞中，TRIM37[24]和TRIM46[25]可以抑制癌細胞的增殖和腫瘤的生長。TRIM59已被報道為多種人類癌癥的腫瘤啟動子，包括肺癌、胃癌和宮頸癌等。ZHAN等[26]發現，TRIM59通過調控細胞周期蛋白B1（cyclin B1）/細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cycle 25 homolog C，CDC25C）/周 期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）蛋白進而促進非小細胞肺癌的轉移和增殖。此外，有報道稱TRIM59與p53相互作用，促進其在胃腫瘤中的泛素化和降解[15]。LI等[27]研究也證實，TRIM59在胰腺癌中高表達，其通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號軸調控胰腺癌的進展。同樣，研究也證實β-catenin/TCF4信號通路異常激活與多種腫瘤的發生、發展及預后密切相關，抑制β-catenin/TCF4信號通路的激活對腫瘤的治療具有重要意義，針對該信號通路的靶向抑制劑研究更是腫瘤領域研究的熱點。

本研究中發現，TRIM59在骨肉瘤組織中mRNA和蛋白的表達水平均明顯上調。利用siRNA干擾技術沉默TRIM59表達后可抑制骨肉瘤U2-OS細胞的侵襲及遷移能力，而過表達TRIM59則可促進U2-OS細胞的侵襲及遷移能力；隨后通過小鼠體內實驗也證實了TRIM59下調能夠抑制U2-OS細胞的轉移能力。最后本研究在機制上證實了，TRIM59通過激活β-catenin信號通路進而影響骨肉瘤的侵襲及遷移。綜上所述，本研究結果可能為骨肉瘤的靶向治療提供更多的初步理論依據。