E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101體外和體內抑制結腸癌HCT-116細胞增殖

卞京，李夏伊，鄭于銘，徐文暉，朱美玲，鄭磊貞

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第3大常見的惡性腫瘤和第2大常見的腫瘤死亡原因[1]，全球每年死于結直腸癌的病例數約90萬[2]，約占全部癌癥及癌癥相關死因的10%，嚴重威脅人類健康。近年來，我國結直腸癌的發病率和死亡率均呈快速上升的趨勢，傳統化療藥物的使用效果進入瓶頸期。結腸癌的治療經歷了從單純化療到分子靶向藥物和免疫治療藥物的過渡。因此，尋求新的、更加有效的針對晚期結腸癌的治療方案變得刻不容緩。隨著個體化、精準化醫療時代的到來，溶瘤病毒治療方案正成為結腸癌研究的新方向[3]。

溶瘤病毒是一種具有高效復制能力的腫瘤殺傷型病毒，能特異性識別并感染殺傷腫瘤細胞。2006年，經改良的腺病毒溶瘤病毒缺陷型溶瘤腺病毒H101在中國被批準用于治療頭頸部鱗狀細胞癌[4]。缺陷型溶瘤腺病毒H101是世界上首個被批注上市的溶瘤病毒類藥物[5]，其能特異性地殺滅腫瘤細胞，但對正常組織并不會不造成傷害，避免了常規放療和化療等由于選擇性差而引起的造血功能抑制、脫發以及肝腎功能損害等不良反應。缺陷型溶瘤腺病毒H101由5型腺病毒通過基因工程改造而成，通過刪除E1B區編碼的55 kDa蛋白的序列（E1B-55kDa）和E3區78.3～85.8 μm的基因片段，降低了病毒的復制能力。

既往研究發現，缺陷型溶瘤腺病毒H101在體外可抑制食管癌[6-7]、葡萄膜黑素瘤[8-9]、肝癌[10-12]以及肺癌[13]等腫瘤細胞的增殖并誘導腫瘤細胞的死亡。然而，缺陷型溶瘤腺病毒H101對結腸癌細胞的抗腫瘤作用目前尚不清楚。因此，本研究選擇結腸癌HCT-116、SW480和RKO細胞作為研究對象，用E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101感染各株細胞后，檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對結腸癌細胞的增殖、細胞形態、遷移、侵襲和細胞周期等的影響，以評估其在體外的抗腫瘤作用；并通過建立結腸癌HCT-116細胞的裸鼠皮下移植瘤模型，進一步驗證其在體內的抗腫瘤作用。本研究為闡明溶瘤腺病毒缺陷型H101參與結直腸癌發生和發展的生物學機制提供重要的理論依據，并為今后采用新的、有效的結直腸癌治療方法提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗動物

結腸癌HCT-116、SW480和RKO細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。BALB/c裸鼠、3～4周齡、雄性購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0012]。

1.2 試劑和儀器

重組人5型腺病毒注射液（H101）由上海三維生物技術有限公司惠贈。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青鏈霉素、含EDTA的胰蛋白酶和二甲亞砜（DMSO）購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養液購自美國HyClone公司。CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、4%多聚甲醛溶液、結晶紫染液、RIPA裂解液、PMSF、快速封閉液、抗體稀釋液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自中國碧云天公司。預染蛋白Marker購自美國Thermo公司。鼠抗人Hexon單克隆抗體購自美國Santa公司，兔抗人GAPDH（內參照）多克隆抗體購自美國Bioworld公司。TBST購自生工生物工程（上海）股份有限公司，PVDF膜和電化學發光液購自美國Millipore公司，Transwell小室購自美國Corning公司，基質膠購自美國BD公司。

流式細胞分析儀（型號：B49007AD）為美國BD公司產品，化學發光成像儀（型號：ChemidocXRS+Gel 3004081）為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 細胞培養

結腸癌HCT-116、SW480和RKO細胞株用含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中進行培養。待細胞融合度達80%～90%時，用胰蛋白酶消化細胞，離心重懸后進行傳代處理，取對數生長期、狀態良好的細胞用作后續實驗。

1.4 病毒感染

將細胞接種于96孔、6孔、12孔板或直徑為60 mm的培養皿中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養過夜，第2天換成含不同效價（1.0×106、2.5×106、5.0×106、7.5×106和1.0×107vp/mL）缺陷型溶瘤腺病毒H101的培養液，對照組為加入不含病毒的培養液。

1.5 CCK-8法檢測細胞的生存能力

將對數生長期的HCT-116、SW480和RKO細胞接種于96孔板中，5×103個細胞/孔。將96孔板置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養過夜，至細胞貼壁生長。實驗設立實驗組、對照組及空白組：實驗組為待細胞貼壁生長后，除去培養液，換為含不同效價（1.0×106、2.5×106、5.0×106、7.5×106和1.0×107vp/mL）缺陷型溶瘤腺病毒H101的培養液處理細胞；對照組為待細胞貼壁生長后，除去培養液，加入不含病毒的培養液處理細胞；空白組中不接種細胞僅加入不含病毒的培養液；每孔培養液的體積為100 μL，每組設置3個復孔。病毒感染24、48和72 h后，分別除去培養液，加入10 μL CCK-8試劑；在培養箱中避光處理2 h后取出96孔板，在酶聯免疫檢測儀波長450 nm波長處測量各孔的D值，并計算各組細胞的存活率。細胞存活率（%）＝（實驗組D值-空白組D值）/（對照組D值-空白組D值）×100%。

1.6 細胞形態學分析

取處于對數生長期的HCT-116細胞（5×105個）接種到直徑為60 mm的培養皿中，待細胞貼壁后，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組中加入含效價為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養液，對照組中加入不含病毒的培養液；將細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養72 h后，在光學顯微鏡下觀察各組細胞的形態，并對實驗結果進行拍照。

1.7 細胞集落形成實驗

將處于對數生長期的HCT-116細胞（5×105個）接種至60 mm 的培養皿中，待細胞貼壁后，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組中加入含效價為1.0×106和2.5×106vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養液，對照組中加入不含病毒的培養液。將細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養48 h后，將細胞接種于6孔板中（500個細胞/孔）。將6孔板置于培養箱中培養，每天在光學顯微鏡下觀察細胞集落形成情況。待觀察到大部分細胞集落所含細胞數＞50個時，終止培養。棄去培養液，用PBS清洗2次后，加入4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min；除去4%多聚甲醛溶液，用PBS清洗2次后，加入結晶紫染液染色15 min；除去結晶紫染液，清水洗凈，空氣干燥后，拍照并計數細胞集落數。

1.8 蛋白質印跡法檢測Hexon蛋白的表達水平

取處于對數生長期的HCT-116細胞（5×105個）接種至60 mm 的培養皿中，待細胞貼壁后，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組中加入含效價為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養液，對照組中加入不含病毒的培養液。將2組細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養72 h后，提取細胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每孔加入20 μg蛋白樣品，進行SDS-PAGE（分離膠濃度為10%）分離蛋白。電泳結束后，采用濕轉法將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，然后用快速封閉液封閉15 min。隨后，分別加入一抗[鼠抗人Hexon單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 000），兔抗人GAPDH（內參照）多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶5 000）] 4 ℃條件下反應過夜；次日用TBST清洗膜3次，每次10 min，室溫下加入二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG（體積稀釋比例均為1∶5 000）]，置于搖床上室溫條件下孵育1 h，再用TBST清洗3次，每次10 min。配制并滴加電化學發光液，經Bio-Rad成像系統顯影，采用Image Lab 5軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.9 Transwell小室實驗檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細胞遷移和侵襲能力的影響

取處于對數生長期的HCT-116細胞（5×105個）接種至60 mm 的培養皿中，待細胞貼壁后，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組加入含效價為1.0×106和2.5×106vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養液，對照組中加入不含病毒的培養液。將各組細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養48 h后，消化計數，調整細胞密度為2.5×105個/mL；在小室的上室中接種200 μL不含FBS的細胞懸液，小室的下室中加入600 μL含FBS的培養液。將小室置于胞培養箱中培養24 h后，取出小室，除去上層液體，加入4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min后，PBS清洗2次。用棉簽將上室中未穿過小室膜的細胞輕柔擦去，加入結晶紫染液染色15 min。清水洗凈，空氣干燥后，拍照，每個小室選取3個視野。

細胞侵襲實驗中，提前將基質膠與無血清培養液按1∶7的體積稀釋比例稀釋后，以每孔100 μL的體積均勻鋪于Transwell小室的上室膜上，置于37 ℃細胞培養箱中靜置4～5 h，待其凝固成膜后行小室侵襲實驗，其余操作同細胞遷移實驗。

1.10 FCM法檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對細胞周期的影響

取處于對數生長期的HCT-116細胞（5×105個）接種至60 mm 的培養皿中，待細胞貼壁后，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組加入含效價為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101培養液，對照組中加入不含病毒的培養液。將2組細胞置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養72 h后消化細胞，離心后收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2遍；緩慢加入700 μL預冷的無水乙醇溶液，于-20 ℃條件下固定過夜。收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞，加入碘化丙啶染色液，37 ℃避光處理30 min后上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.11 構建裸鼠皮下移植瘤模型

14只3～4周齡的雄性BALB/c裸鼠在室溫25 ℃、相對濕度為40%～70%、12 h光-暗交替的環境下適應性喂養7 d后，構建皮下移植瘤模型。將處于對數生長期且生長狀態良好的結腸癌HCT-116細胞消化和離心后，用無血清的DMEM高糖培養液重懸細胞，并將細胞懸液調整為5×107個/mL，置于冰上備用。選取裸鼠右側臀部上方皮下位置作為進針點，常規皮膚消毒后，緩慢推注100 μL腫瘤細胞懸液（5×106個HCT-116細胞），觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤的生長情況。細胞接種4 d后，皮下種植瘤體積達到80 mm3時開始給藥，采用隨機分組的方法，將小鼠分為2組，每組7只。根據既往研究結果給藥：實驗組每天瘤內注射缺陷型溶瘤腺病毒H101（1×1010vp/只），第5～第9天；對照組每天瘤內注射等體積的PBS，第5～第9天。每2 d用體重計測量裸鼠的體質量，每2 d用游標卡尺測量腫瘤長徑（a）和腫瘤短徑（b），并計算腫瘤體積（VT）（VT＝0.5×a×b2）。治療結束后，第14天時處死所有裸鼠，從皮下盡可能完整地剝取腫瘤組織，電子天平上稱取腫瘤質量，并計算抑瘤率，抑瘤率（%）＝（對照組平均腫瘤質量-實驗組平均腫瘤質量）/對照組腫瘤質量×100%。

將取得的新鮮腫瘤組織置于甲醛溶液中固定，由上海睿寶和生物科技有限公司進行HE染色，并采用免疫組織化學法檢測Ki-67和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況。

1.12 統計學方法

所有實驗數據采用GraphPad Prism 7軟件進行統計處理分析。所有實驗均獨立重復3次，計量資料以表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間首先采用單因素方差分析，再行組內兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺陷型溶瘤腺病毒H101降低結腸癌HCT-116細胞的生長活力

用不同效價（1.0×106、2.5×106、5.0×106、7.5×106和1.0×107vp/mL）的缺陷型溶瘤腺病毒H101作用于HCT-116、SW480和RKO細胞24、48和72 h后，采用CCK-8法檢測對結腸癌增殖的影響。結果（圖1A）顯示，缺陷型溶瘤腺病毒H101能明顯抑制HCT-116細胞的存活率（P均＜0.05），且呈一定的濃度依賴性和時間依賴性；而SW480和RKO細胞中，相較與對照組，僅在缺陷型溶瘤腺病毒H101效價較高（1.0×107vp/mL）和作用時間較長（72 h）的情況下，細胞的增殖被抑制，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，本研究選用更敏感的結腸癌HCT-116細胞進行后續實驗。

采用效價為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101處理HCT-116細胞72 h后，在光學顯微鏡下觀察細胞形態學變化。結果（圖1B）顯示，對照組中HCT-116細胞呈貼壁生長狀態且生長迅速，細胞與細胞間的間隙較窄，細胞的胞質飽滿，胞膜清晰；而缺陷型溶瘤腺病毒H101感染后HCT-116細胞與細胞間的間隙增寬，細胞密度降低，細胞數目不斷減少，細胞失去正常形態，懸浮細胞數目增多，并出現細胞破裂導致膜內容物流出的現象。

為進一步觀察缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細胞增殖的抑制作用，根據CCK-8法檢測結果，采用低效價的缺陷型溶瘤腺病毒H101（1.0×106和2.5×106vp/mL）進行細胞集落形成實驗。檢測結果（圖1C）顯示，對照組、缺陷型溶瘤腺病毒（1.0×106vp/mL）組、缺陷型溶瘤腺病毒（2.5×106vp/mL）組的克隆形成數分別為（438.67±16.50）個、（196.67±18.77）個 和（72.67±2.08）個。與對照組相比，不同效價的缺陷型溶瘤腺病毒H101的集落形成能力均受到不同程度的抑制，差異有統計學意義（P均＜0.001）。

為進一步驗證缺陷型溶瘤腺病毒H101在結腸癌HCT-116細胞中的感染效率，用效價為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101感染HCT-116細胞72 h后，采用蛋白質印跡法檢測HCT-116細胞中腺病毒衣殼蛋白Hexon的表達情況。結果（圖1D）顯示，與對照組相比，Hexon在缺陷型溶瘤腺病毒H101感染的HCT-116細胞中高表達，差異具有統計學意義（P＜0.001）。這一結果提示，缺陷型溶瘤腺病毒H101可在結腸癌HCT-116細胞中有效表達。

2.2 缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制HCT-116細胞的遷移與侵襲

用效價為1.0×106和2.5×106vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101處理HCT-116細胞48 h后，采用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力（圖2）。細胞遷移實驗檢測結果顯示，對照組中每視野下發生遷移的細胞數為（203.67±10.21）個，而效價為1.0×106vp/mL和2.5×106vp/mL缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組中發生遷移的細胞數為（123.50±15.63）個和（79.50±2.63）個；與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組發生遷移的細胞數均明顯降低，差異有統計學意義（P均＜0.001）。

細胞侵襲實驗檢測結果顯示，對照組中每視野下發生侵襲的細胞數為（156.00±14.11）個，而效價為1.0×106vp/mL和2.5×106vp/mL缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組中發生侵襲的細胞數為（86.33±8.50）個和（37.33±5.86）個；與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組發生侵襲的細胞數均明顯降低，差異具有統計學意義（P均＜0.001）。上述結果提示，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染結腸癌HCT-116細胞后，能明顯抑制結腸癌細胞的遷移及侵襲能力。

Fig.1 The cell viabilities of colon cancer HCT-116,SW480 and RKO cells treated with different virus titers (1.0×106,2.5×106,5.0×106,7.5×106 and 1.0×107 vp/mL) of defective oncolytic adenovirus H101 for 24,48 and 72 h were detected by CCK-8 assay (A).The cell morphology of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×107 vp/mL) for 72 h was observed under a light microscope (B).The colony formation ability of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×106 and 2.5×106 vp/mL) for 48 h was detected by colony formation assay (C).The expression level of adenovirus Hexon protein in HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×107 vp/mL) for 72 h was detected by Western blotting (D).HCT-116 cells were treated without any drugs as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖1 分別采用CCK-8法（A）、細胞形態學分析（B）和細胞集落形成實驗（C）檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對結腸癌細胞增殖的影響以及蛋白質印跡法檢測腺病毒衣殼蛋白Hexon在HCT-116細胞中的表達情況（D）

2.3 缺陷型溶瘤腺病毒H101阻滯HCT-116細胞的細胞周期

采用FCM法檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細胞周期的影響。用效價為1.0×107vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101處理HCT-116細胞72 h后，結果（圖3）顯示對照組中S期細胞所占百分比為（6.82±3.33）%，而缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組S期細胞所占百分比為（20.85±2.04）%；與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染組S期細胞所占百分比明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這一結果提示，缺陷型溶瘤腺病毒H101可將HCT-116細胞的細胞周期阻滯在S期。

2.4 缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制裸鼠皮下移植瘤的生長

Fig.2 The migration and invasion abilities of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101 (1.0×106 and 2.5×106 vp/mL) for 48 h were detected by Transwell chamber assay (crystal violet staining,×100).HCT-116 cells were treated without any drugs as the control.**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖2 Transwell小室實驗檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101處理后對結腸癌細胞HCT-116細胞遷移和侵襲能力的影響

Fig.3 The cell cycle distribution of HCT-116 cells treated with defective oncolytic adenovirus H101(1.0×107 vp/mL) for 72 h was detected by FCM method.HCT-116 cells were treated without any drugs as the control.**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖3 FCM法檢測缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細胞周期的影響

Fig.4 The growth of HCT-116 cell xenograft tumor in nude mice was inhibited by defective oncolytic adenovirus H101.A: The gross picture of HCT-116 cell xenograft tumor mice;The tumor volume and tumor weight of HCT-116 cell xenograft tumor mice;B: The HE staining result (×100) of tumor tissues;C: The expression levels of Ki-67 and VEGF were detected by immunohistochemistry (DAB staining,×100).H101 group: The nude mice bearing HCT-116 cell xenograft tumor treated with defective oncolytic adenovirus H101 (intratumoral injection,1.0×107 vp/piece);Control group: The nude mice bearing HCT-116 cell xenograft tumor treated with PBS (intratumoral injection,1.0×107 vp/piece).*P＜0.05,***P＜0.001,vs the control group (n=7).圖4 缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制裸鼠皮下移植瘤的生長

構建裸鼠皮下移植瘤模型，進一步觀察缺陷型溶瘤腺病毒H101對結腸癌抑制作用。結果（圖4A）顯示，與對照組相比，缺陷型溶瘤腺病毒H101能明顯抑制HCT-116細胞裸鼠皮下移植瘤的生長。繪制裸鼠皮下移植瘤生長曲線圖，結果顯示，第14天時缺陷型溶瘤腺病毒H101治療組裸鼠皮下移植瘤體積為（221.76±119.40）mm3，明顯小于對照組的（1 027.86±277.54）mm3，差異具有統計學意義（P＜0.001）。缺陷型溶瘤腺病毒H101組裸鼠皮下移植瘤質量為（0.054 9±0.080 1）g，明顯小于對照組的（0.711 2±0.125 5）g，差異具有統計學意義（P＜0.001）。計算結果顯示，缺陷型溶瘤腺病毒H101的抑瘤率為92.28%。上述結果表明，缺陷型溶瘤腺病毒H101顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的體內生長，具有很好的體內抗腫瘤作用。

皮下移植瘤組織經HE染色后，光學顯微鏡鏡下觀察發現（圖4B），對照組腫瘤組織中以實體腫瘤組織為主，腫瘤細胞彌漫分布，有大量炎癥細胞浸潤，壞死區域極少，腫瘤組織中心可見大量血管增生。而缺陷型溶瘤腺病毒H101治療組腫瘤組織中可見細胞大面積壞死，細胞核異型性明顯，大量細胞核消失留下殘影，可見大面積炎癥細胞浸潤。

應用免疫組織化學法檢測移植瘤中Ki-67和VEGF的表達情況（圖4C）。結果顯示對照組腫瘤組織中Ki-67蛋白陽性細胞分布較廣，而缺陷型溶瘤腺病毒H101干預后，腫瘤組織中Ki-67蛋白陽性表達的細胞數明顯減少；這一結果說明，缺陷型溶瘤腺病毒H101能明顯抑制腫瘤細胞增殖，使腫瘤組織生長減弱。應用免疫組織化學法檢測移植瘤中VEGF蛋白的表達情況，結果顯示對照組結腸癌移植瘤內VEGF表達陽性細胞的分布較廣，而缺陷型溶瘤腺病毒H101干預后，VEGF陽性表達的細胞數明顯減少；這一結果說明，缺陷型溶瘤腺病毒H101明顯抑制腫瘤組織中血管生成。

3 討論

溶瘤腺病毒是一種直徑為70～90 nm、基因組大小為25～45×103bp的無包膜的雙鏈DNA病毒[14]。在正常細胞被腺病毒感染時，會表達與病毒復制有關的早期基因E1A和E1B。其中E1A可調節視網膜母細胞瘤相關蛋白（retinoblastoma associated protein，Rb）。E1B編碼的一種大小為55 kDa的蛋白（E1B-55kDa），其可以使細胞抑癌基因p53失活，從而有利于病毒復制。缺陷型溶瘤腺病毒H101是一種重組人5型腺病毒，刪除了E1B區編碼55kD蛋白的序列和E3區78.3～85.8 μm的基因片段，降低了病毒的復制能力[5]。

細胞增殖與細胞死亡的調控失衡是細胞發生惡變的核心。正常細胞可以通過調控促生長信號的產生和釋放，維持正常的結構和功能；而腫瘤細胞逃避正常的信號調控，呈現無限增殖的狀態。因此，抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞死亡是治療腫瘤的重要方式。本研究結果顯示，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染HCT-116細胞后，細胞的生長活力和集落形成能力被顯著抑制，提示腫瘤細胞的增殖能力被大大減弱。進一步檢測其遷移及侵襲能力，發現缺陷型溶瘤腺病毒H101感染后HCT-116細胞的遷移及侵襲能力明顯降低。破壞宿主細胞的復制周期，是許多病毒用來創建有利于病毒復制的細胞環境的常用策略。研究發現，異常的細胞周期控制和E1A的表達與溶瘤腺病毒活性之間關系密切，功能失調的細胞周期有利于提高溶瘤腺病毒的功效[15]。LEI等[13]研究發現，H101可通過細胞周期停滯和細胞壞死誘導對肺癌XWLC-05細胞的細胞毒性作用；SONG等[16]研究發現，H101在視網膜母細胞瘤HXO-RB44細胞中大量復制，其殺傷腫瘤和抑制生長的作用與H101導致的細胞G2/M期停滯并直接裂解腫瘤細胞有關，這與CHERΜBINI等[17]的研究結果一致。本研究發現，缺陷型溶瘤腺病毒H101感染過的HCT-116細胞，S期細胞所占百分比明顯增加，提示H101可能通過使細胞停滯在S期抑制結腸癌細胞的增殖，從而達到抗腫瘤的作用。上述結果表明，E1B-55kDa缺陷型溶瘤腺病毒H101對HCT-116細胞具有明顯的體外抗腫瘤作用。

根據體外研究結果，本研究進一步構建了裸鼠皮下移植瘤模型，以觀察缺陷型溶瘤腺病毒H101對結腸癌細胞體內抗腫瘤作用。采用BALB/c裸鼠作為荷瘤動物，剔除了免疫系統對病毒抗腫瘤效能的影響，可直接觀察病毒的抗腫瘤作用。溶瘤病毒的給藥途徑通常包括瘤內注射、靜脈內注射和腹膜內注射等[18]。瘤內注射多用于實體腫瘤的治療，是溶瘤病毒最常用的給藥方式，目前已在多項Ⅲ期臨床試驗中證明有效[19]，但該方法存在操作復雜、介入昂貴和不良反應多等缺點。靜脈內注射多用于轉移性腫瘤患者、血液治療患者或者對血清中的抗體有抵抗力的患者，但該方法的不足之處在于，溶瘤病毒不能直接到達病灶，需經過血液的稀釋且易被肝臟、脾臟等器官和血清中的抗體中和殺傷，導致其在病灶中難以達到有效濃度，此外，靜脈內注射還可能引起全身擴散，引發嚴重感染。一項針對瘤內注射及靜脈內注射有效性和安全性進行分析的Meta分析發現，瘤內注射的給藥方式對療效有顯著改善（P＝0.000 2），而靜脈注射無顯著改善（P＝0.99）[20]。因此，本實驗選用瘤內注射進行H101的治療。

缺陷型溶瘤腺病毒H101瘤內注射的裸鼠瘤體的生長速度明顯比對照組減緩。腫瘤組織HE染色后觀察發現，對照組腫瘤組織以實體腫瘤組織為主，腫瘤組織內未見明顯壞死；而缺陷型溶瘤腺病毒H101治療組中可見大面積細胞壞死，細胞核異型性明顯，大量細胞核消失留下殘影，其內可見大量炎性細胞浸潤。缺陷型溶瘤腺病毒H101瘤內注射組腫瘤組織中Ki-67陽性表達細胞分布明顯降低，這一結果表明缺陷型溶瘤腺病毒H101能顯著抑制腫瘤細胞的增殖，這一結果與體外細胞實驗結果相符。有研究發現，溶瘤病毒可影響腫瘤的脈管系統，促進腫瘤內血管萎縮，并具有抗血管生成作用[21]。被病毒感染的腫瘤細胞分泌促炎細胞因子，其中中性粒細胞的浸潤可導致血栓形成、急性缺血和腫瘤細胞死亡[22]。此外，痘苗病毒株能夠在腫瘤相關的內皮細胞內感染并復制，從而直接導致內皮細胞的破壞和血管塌陷，腫瘤內出現缺氧和大量壞死[23]，這在晚期肝細胞癌臨床實驗中得到了證實。除了促進腫瘤內血管萎縮外，溶瘤病毒具有抗腫瘤血管生成特性，被感染的腫瘤內VEGF表達水平被明顯降低[24]。有研究顯示，一種新型的，表達FP3（VEGF誘餌受體）的溶瘤腺病毒（RdB/FP3/Ad）可大大降低VEGF的表達水平和血管密度并增加腫瘤內皮細胞和腫瘤細胞的凋亡，有效抑制VEGF介導的腫瘤血管生成作用[25]。本研究發現，經缺陷型溶瘤腺病毒H101瘤內注射后的腫瘤組織中VEGF蛋白陽性表達細胞的分布明顯降低，這一結果同樣提示缺陷型溶瘤腺病毒H101具有抗腫瘤血管生成的作用。因此，通過體內實驗同樣表明，E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101可抑制結腸癌HCT-116細胞的增殖，具有抗腫瘤作用。

綜上所述，E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101對結腸癌HCT-116細胞具有顯著的體內和體外抗腫瘤作用，是一個潛在的抗腫瘤藥物，其在結腸癌臨床治療中可能有良好的應用前景。