靶向CD47抗腫瘤治療的研究進展

柳菁菁 ，唐辰晨，李慧，程穎

近年來，以程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic lymphocyte antigen 4，CTLA-4）為代表的免疫檢查點抑制劑在惡性腫瘤的治療中取得了顯著的療效，并相繼獲批上市，成為惡性黑素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）、胃腸系統腫瘤、腎癌和尿路上皮癌等實體腫瘤的標準治療方案，開創了抗腫瘤治療的新時代，實現了腫瘤患者的長期生存[1]。雖然免疫治療取得了突破性進展，但其有效率僅在30%左右，發現新的免疫靶點、研發新型藥物已成為目前的研究熱點。

一般情況下，正常組織和細胞可通過表達抗吞噬作用分子來避免被吞噬細胞吞噬的能力，對癌細胞而言則可依賴于類似的機制來逃避免疫消除[2-4]。因此，識別和靶向吞噬作用的檢查點被認為有可能是消除腫瘤免疫逃逸的新途徑[5]。CD47是一種廣泛表達于多種細胞膜表面的免疫球蛋白樣蛋白質，在多種腫瘤細胞高表達，能夠與巨噬細胞表面的信號調節蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）結合，向巨噬細胞發出“別吃我”信號，使得腫瘤細胞逃避免疫監視[6-9]。此外，CD47還與腫瘤細胞凋亡和增殖等細胞學過程密切相關。目前，阻斷CD47/SIRPα信號從而恢復巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用成為抗腫瘤新藥研發的熱點方向之一。本文將就CD47的結構和功能、靶向CD47新藥的研究現狀和進展等進行系統闡述。

1 CD47的發現和鑒定

CD47是一種相對分子質量為44～55 kDa的細胞表面糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族（IgSF）[10]，其由5個跨膜結構域、1個細胞外N末端IgV結構域和一個細胞質內C末端交替剪接結構域組成，根據其在細胞內尾部4種可變不同剪接異構體分為4個亞型。亞型1在角質形成細胞中表達，亞型2主要在造血細胞、血管內皮細胞和上皮細胞中表達，亞型3和亞型4在神經元細胞、腸黏膜細胞和睪丸細胞中均有表達。20世紀80年代，CD47首次被鑒定為人卵巢癌的腫瘤抗原（圖1），因為其與整合素αvβ3結合，因此被稱為整合素相關蛋白（integrin associated protein，IAP）[11]。1994年，LINDBERG等[12]在缺乏整合素的紅細胞表面上發現了CD47，證明CD47可獨立于整合素而介導細胞信號轉導，因此以CD47命名逐漸代替了IAP。多項研究證實，CD47幾乎在所有正常人類細胞中都有表達，并且在多種腫瘤細胞表面高表達，其表達水平和腫瘤的預后呈負相關[5,13]。

Fig.1 Research progress in CD47-signal regulatory protein α (SIRPα) in cancer圖1 CD47-SIRPα軸在腫瘤中的研究進展

2 CD47的受體

CD47主要與整合素（integrins）、血小板反應蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）和SIRPα這3類細胞外受體相互作用，進而調節細胞黏附、細胞遷移以及炎性反應和吞噬等功能[14]。CD47可以與整合素αvβ3、αⅡbβ3、α2β1、α4β1、α5和α6β1等多個亞型相互作用[14-16,20-21]，形成的復合體，連接到細胞內配體細胞骨架1（protein linking IAP with cytoskeleton-1，PLIC-1），從而激活異三聚體G蛋白，形成CD47-整合素-G蛋白復合體，介導多種細胞效應，如誘導環磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號激活。

TSP-1為一種同三聚體多結構域細胞外基質糖蛋白，TSP1通過其碳末端結合結構域（C-terminal binding domain）上的VVM序列與CD47相結合，進而影響多種細胞功能，如細胞遷移和黏附、細胞增殖和凋亡、調節血管生成和炎性反應等[16-17]。

SIRPα是一種有3個IgSF結構域的跨膜蛋白，在巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞及造血干細胞等髓系細胞系廣泛表達[18]，包含4個酪氨酸磷酸化位點和2個免疫受體酪氨酸相關的抑制性基 序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）。CD47與SIRPα結 合，可誘導ITIM發生磷酸化[19]，招募和激活不同的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPase）（如酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2）[20]，導致肌球蛋白ⅡA（myosin IIA）去磷酸化發生解聚[21]，從而抑制巨噬細胞的吞噬功能[22]（圖2）。

3 靶向CD47的抗腫瘤作用及機制

3.1 直接誘導腫瘤細胞的凋亡

有研究表明，在許多白血病細胞中，如慢性B淋巴細胞白血病細胞、早幼粒細胞白血病NB4細胞和Jurkat T細胞，CD47抗體與TSP-1結合后，通過半胱天冬酶獨立細胞死亡方式誘導細胞凋亡。CD47誘導凋亡的作用不僅限于白血病，在人乳腺癌MCF-7、AU-565和MDA-MB-231細胞中，抗CD47抗體4N1K可激發CD47誘導細胞凋亡[23]。抗CD47抗體對誘導癌細胞凋亡的影響各不相同，其原因可能包括：每個抗體的特異性CD47靶向域不同、免疫球蛋白G（immunoglobin G，IgG）的不同亞型、參與抗體的連接方式不同等[24-25]。

Fig.2 Regulatory effect of CD47-signal regulatory protein α (SIRPα) axis on phagocytosis.ITIM:Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif.圖2 CD47-SIRPα軸對吞噬作用的調節

3.2 增強吞噬細胞的吞噬作用

抑制CD47-SIRPα軸可以促進吞噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。體外研究證明，抗CD47抗體阻斷CD47-SIRPα信號通路可以促使巨噬細胞吞噬急性髓系白血病干細胞，但不吞噬CD34陽性表達（CD34＋）的正常細胞。體內和體外實驗證實，阻斷CD47-SIRPα還可增強中性粒細胞對腫瘤細胞的吞噬作用[11]。該研究同時進一步揭示了CD47調控細胞的機制，發現激活SIRPα及其下游靶點，改變CD47與SIRPα的連接位置；并且在吞噬突觸處激活SIRPα可抑制整聯蛋白的活化，從而限制了巨噬細胞的擴散；再利用化學方法激活整聯蛋白，即可恢復吞噬作用。由此證實了，CD47-SIRPα抑制巨噬細胞的吞噬可能是通過由內而外的抑制整聯蛋白信號發揮作用，此機制的發現對癌癥免疫療法的應用產生了影響。

3.3 促進樹突狀細胞的吞噬作用與細胞因子的產生

腫瘤細胞表面的CD47與樹突細胞上的SIRPα復合物結合，可抑制樹突細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。CD47和SIRPα間的相互作用可能抑制樹突狀細胞的成熟和樹突狀細胞產生炎性細胞因子[26-27]。此外，樹突狀細胞也可以介導腫瘤抗原呈遞給T細胞，從而激活獲得性免疫反應[5]。

3.4 加強抗體依賴性細胞毒性（antibodydependent cellular cytotoxicity，ADCC）和補體依賴細胞毒性（complement-dependentcytotoxicity，CDC）

有研究表明，獲得性免疫系統的激活也可能是抗CD47的抗腫瘤作用機制[5]。抗CD47抗體可能通過Fc依賴的ADCC和CDC途徑清除腫瘤細胞。此外，抗CD47抗體可以通過中性粒細胞激活ADCC從而清除腫瘤細胞，與CD47-SIRPα軸共同通過先天性免疫系統發揮抗腫瘤作用。ADCC或CDC通路的激活依賴于抗CD47抗體IgG亞型的特異性，因IgG不同亞型引發ADCC和CDC的能力不同[28]。

4 靶向CD47新藥在腫瘤治療中的臨床研究進展

目前已有多種靶向CD47-SIRPα軸的抗體和小分子抑制劑正在不同的腫瘤中進行臨床研究（表1）。然而，由于紅細胞表面同樣表達CD47，因此較早研發的藥物會導致巨噬細胞錯誤的清除健康的紅細胞，使患者出現嚴重貧血等不良反應[29]。此外，淋巴細胞、血小板細胞、胎盤細胞、肝細胞和腦細胞等也有較高的CD47表達，可導致一些藥物引起高膽紅素血癥和血小板減少癥等不良反應[30-31]。2018年12月，抗CD47單抗Ti-061和CC-90002就因為臨床安全問題終止了研究。因此CD47靶向藥物在臨床開發中，已采用低起始劑量、維持劑量等多種策略來減輕其毒性。

4.1 CD47單克隆藥物

4.1.1 Hu5F9-G4（magrolimab）

Hu5F9-G4是一種人源化抗CD47單克隆抗體[32]。在小鼠異種移植瘤模型中，Hu5F9-G4能夠吞噬多種淋巴瘤細胞和實體瘤細胞[25,33-37]，并可選擇性地清除腫瘤細胞而不影響正常細胞。一項Hu5F9-G4聯合利妥昔單抗治療非霍奇金淋巴瘤的Ⅰb期研究評價了靜脈注射Hu5F9-G4（起始劑量為1 mg/kg，靜脈注射，每周10～30 mg/kg維持劑量）與利妥昔單抗聯合用藥的安全性及有效性，并因此確定Ⅱ期研究的推薦劑量[38]。該研究結果顯示，22例入組的患者中（15例彌漫大B細胞淋巴瘤，7例濾泡性淋巴瘤），治療相關不良事件主要為1或2級，貧血和輸液相關反應是最常見的不良反應。Hu5F9-G4起始劑量和維持劑量可減輕貧血的發生率，劑量限制性毒性（doselimiting toxicities，DLTs）事件少見。在推薦的Ⅱ期劑量下（30 mg/kg），客觀緩解率（objetive response rate，ORR）達到50%，36%的患者達到完全緩解（complete response，CR）。除了聯合治療的策略外，Hu5F9-G4單藥治療在實體瘤患者中也顯示了較好的安全性和初步療效。在Hu5F9-G4首次治療晚期實體瘤的臨床研究中[39]，將62例患者隨機分為4個隊列，其中隊列A（11例）用于確定起效劑量；隊列B（14例）用于確定每周維持劑量；隊列C（22例）用于研究第2周的負荷劑量；另設一個腫瘤活檢隊列（15例）。隊列A中，劑量為0.1～3.0 mg/kg；在隨后的治療組中，患者接受了3～45 mg/kg的維持劑量治療，大多數不良反應為輕度至中度，包括短暫性貧血（57%）、外周血涂片血凝反應（36%）、乏力（64%）、頭痛（50%）、發熱（45%）、寒戰（45%）、高膽紅素血癥（34%）、淋巴細胞減少（34%）、輸液相關反應（34%）和骨骼肌疼痛（18%）。然而，維持劑量高達45 mg/kg時并沒有達到最大耐受劑量。Hu5F9-G4可以在10 mg/kg或更高的劑量下克服CD47抗原沉默現象。在30 mg/kg劑量下，有1例患者的腫瘤組織可見強抗體染色。2例獲得部分緩解（partial response，PR）卵巢/輸卵管癌患者的緩解時間分別為5.2和9.2個月。最終確定起始1 mg/kg，每周維持劑量為45 mg/kg為Hu5F9-G4的推薦劑量。除了實體瘤以外，Hu5F9-G4在血液系統疾病中的治療也進行了探索。2019年第61屆美國血液學會年會（American Society of Hematology，ASH）會議上公布了Hu5F9-G4聯合阿扎胞苷對初治高風險骨髓增生異常綜合癥和不適宜誘導化療的急性髓細胞性白血病患者的研究數據，ORR分別為92%和64%，CR更是達到50%以上。常見治療相關的不良事件為貧血（37%）、中性粒細胞減少癥（26%）和血小板減少癥（26%）[40]。2020年，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）也給予了Hu5F9-G4治療新診斷骨髓增生異常綜合癥的突破性療法資格。

4.1.2 Lemzoparlimab（TJC4）

Lemzoparlimab（TJC4）是中國自主研發的新型全人源化CD47單克隆抗體，其創新點在于保證抗腫瘤活性的同時，能夠最大程度地減少與正常紅細胞結合，從而減少臨床嚴重貧血的發生。在2020年癌癥免疫治療年會（Society for Immunotherapy of Cancer，SITC）上報告了一項Ⅰ期臨床試驗數據[41]，該研究分為2部分，第1部分為單藥劑量爬坡遞增后，在遞增劑量范圍內采用的2種聯合用藥方案[Ⅰb期時聯用帕博利珠單抗（pembrolizumab），Ⅰc期時聯用利妥昔單抗]；第2部分為上述2種聯合療法的劑量擴展研究。單藥劑量爬坡組中共有20名患者入組，Lemzoparlimab每周耐受劑量高達30 mg/kg，沒有發現劑量限制毒性或藥物相關嚴重不良事件，所有治療相關不良事件中除了1例患者出現3級脂肪酶升高外均為1或2級，所有的隊列都觀察到一過性血紅蛋白降低，平均降低率在10%左右且沒有劑量依賴性，沒有藥物相關性貧血的發生。截止到2020年11月10日，已經初步觀察到Lemzoparlimab的治療療效，包括1例PR和3例疾病穩定（stable disease，SD）。目前正在進行Lemzoparlimab聯合帕博利珠單抗治療實體瘤和聯合利妥昔單抗（Rituximab）治療淋巴瘤（NCT03934814）和AML/MDS（NCT04202003）的臨床研究（表1）。

4.1.3 Letaplimab（IBI188）

Letaplimab也是中國自主研發的重組全人源化抗CD47單克隆抗體，在2020年SITC會議上公布了該藥的Ⅰa期臨床研究結果。NCT03763149研究是在美國開展的，旨在評估Letaplimab單藥治療晚期惡性腫瘤（如結腸癌）的耐受性、安全性和藥代動力學（pharmaeokineties，PK）/藥效學（pharmacodynanfics，PD）特性。該研究共設置了7個劑量組，從0.1～30.0 mg/kg，每周給藥1次，直至疾病進展、毒性不可耐受或其他需要終止治療的情況。入組20例受試者，完成了所有預設劑量的爬坡，最高探索劑量為30.0 mg/kg，每周1次，整體耐受性良好，未發生DLTs。與治療相關的不良事件大部分為1～2級，無治療相關死亡發生。總體貧血發生率為15%（3/20），僅1例患者（5%）在首次給藥當天出現3級一過性貧血，第2天恢復，總體而言耐受性良好。信達生物制藥（蘇州）有限公司目前正在中國開展“評估Letaplimab聯合阿扎胞苷治療初診中高危骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）受試者安全性和有效性的Ⅰb/Ⅲ期研究”以及“評估IBI188聯合阿扎胞苷治療急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）受試者安全性及有效性的Ⅰb/Ⅱ期研究”。同時該公司正在美國開展評估IBI188聯合阿扎胞苷治療初診中高危MDS受試者安全性和有效性的Ⅰb期研究。

4.1.4 AK117

AK117是中國研制的第二代抗CD47抗體，2020年SITC會議上公布了其初步研究結果，在澳大利亞-新西蘭臨床試驗注冊中心（Australian New Zeland clinical trials registry，ANZCTR）開展的晚期實體瘤和淋巴瘤患者的劑量遞增臨床試驗中（表1），該研究共設置7個劑量組，從0.3～45.0 mg/kg，每周給藥1次，直至疾病進展、毒性不可耐受或其他需要終止治療的情況。目前已經完成了0.3、1.0和3.0 mg/kg的臨床試驗，正在進行10 mg/kg的劑量爬坡，這些隊列受試者中均未發生藥物相關的貧血癥狀，也無需使用低劑量誘導。各劑量組受試者對藥物耐受性良好，無DLTs事件發生。

4.2 CD47-SIRPα融合蛋白藥物

4.2.1 Trillium（TTI-621和TTI-622）

TTI-621和TTI-622都是利用CD47天然配體SIRP-α不結合紅細胞表面CD47的特點開發的SIRPα-Fc融合蛋白，可結合人腫瘤細胞上的CD47，阻止其向巨噬細胞傳遞抑制性信號，也可以利用巨噬細胞表達的Fc受體進一步增強吞噬作用。臨床前研究表明，TTI-621能與多種人腫瘤細胞上的CD47緊密結合，并選擇性地促進巨噬細胞介導的對血液和實體瘤細胞的吞噬。此外，在小鼠白血病和淋巴瘤模型中，這些體外效應轉化為顯著的抗腫瘤活性[42]。重要的是，TTI-621與人紅細胞的結合最小，最大限度地降低了溶血性貧血相關的潛在毒性[43]。也有研究證明，TTI-621阻斷CD47后可增強巨噬細胞對腫瘤的吞噬作用。在一項I期研究（NCT02663518）中，研究者評估了TTI-621在復發/難治性血液腫瘤中的安全性和抗腫瘤活性[44]；164例淋巴瘤患者接受了TTI-621治療，其中劑量爬坡組18例，擴展隊列146例（35例為聯合西妥昔單抗，4例為聯合納武利尤單抗），治療相關不良事件包括輸注反應、血小板減少、寒戰和疲勞等。目前正在進行一項評估TTI-621單藥或聯合治療在復發/難治性血液惡性腫瘤和實體瘤患者中的作用的臨床研究（NCT02890368）（表1）。

表1 CD47靶向藥物的臨床研究Table 1 Clinical studies of CD47-targeting drugs

與TTI-621采用IgG1的Fc段不同，TTI-622采用IgG4的Fc段，由于TTI-622的IgG4 Fc段與Fc受體的相互作用比IgG1更為有限，因此推測TTI-622會向巨噬細胞傳遞更適度的“吞噬”信號。2020年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）會議上，TTI-622用于治療復發/難治性淋巴瘤的Ⅰ期初步臨床數據公布，已經觀察到1例PR、1例CR，進一步顯示了該類療法的治療潛力。

4.2.3 ALX148

ALX148是一個對CD47高親和力的結合片段與一個無活性的Fc段相融合的融合蛋白。ALX148可抑制CD47與野生型SIRPα結合，從而增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。一項ALX148的多中心Ⅰ期臨床試驗數據顯示，在先前接受含鉑化療病情進展、尚未接受免疫檢查點抑制劑治療的頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）患 者中，ALX418與帕博利珠單抗聯合治療的ORR為40%，中位無進展生存期（progression-fress survival，PFS）為4.6個 月[95%可信區間（confidence interval，CI）為0.5～7.5]，中位總生存期（overall survival，OS）未達到。此外，在先前接受過至少一種抗人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）治療方案后疾病進展的胃/胃食管交界腫瘤患者中，ALX418與曲妥珠單抗聯合治療的ORR為20%，中位PFS為2.2個月（95%CI為1.9～5.4），中位OS期為8.1個月（95%CI為3.4～12.8）。基于這2項研究結果，2020年2月FDA已授予ALX148用于一線治療HNSCC，以及二線治療HER2陽性胃或胃食管交界腺癌患者的快速通道資格認定。

4.3 小分子CD47調節劑

RRx-001是一種小分子免疫調節劑，可以抑制C-myc表達以及下調CD47和PD-L1的表達水平，其還可以使腫瘤相關巨噬細胞從腫瘤前的M2型重極化到抗腫瘤的M1型[45]，恢復對既往一線治療的敏感性。在首個評價RRx-001在人體中安全性、耐受性和藥代動力學的I期研究中[46]，25例實體瘤患者接受10～83 mg/m2不同劑量的RRx-001治療，每1～2周重復1次，至少4周；沒有觀察到DLTs，在21例可評估患者中，1例（5%）為PR，14例（67%）為SD，6例（29%）為PD；患者耐受性良好，最常見的不良反應為注射部位疼痛（84%），主要為1～2級；該研究最終確定Ⅱ期推薦劑量為16.7 mg/m2。BRAINSTORM是一項旨在評估RRx-001聯合全腦放療（whole-brain radiation therapy，WBRT）治療腦轉移瘤的最大耐受劑量研究，在這項2期1/2期研究中共31例患者入組，RRx-001在WBRT前注射1次，在WBRT期間每周注射2次，計劃4個劑量組（5.0、8.4、16.5和27.5 mg/m2）[47]。該研究初步證實了，RRx-001聯合WBRT的良好耐受性和顱內緩解率，沒

有觀察到DLTs，最常見的嚴重不良事件是3級乏力（6.9%，2/29）。中位顱內緩解率為46.0%（95%CI為24.0～68.0），中位總生存期為5.2個月（95%CI為4.5～9.4），無神經系統死亡發生。在一項Ⅱ期QUADRUPLE THREAT研究（NCT02489903）中，SCLC患者在疾病進展后再接受RRx-001治療[每周第1天給予靜脈注射RRx-001（4 mg），共21 d]，隨后給予依托泊苷聯合順鉑或卡鉑再次治療，主要研究終點為OS率和ORR。26例患者中1例（3.8%）為CR，6例（23.1%）為PR，12個月的OS率為44.1%[48]。基于該研究的初步良好結果，目前正在進行RRx-001聯合依托泊苷/順鉑或卡鉑對比含鉑化療三線及以上治療既往接受過免疫治療的SCLC的Ⅲ期研究（REPLATINUM和NCT03777657），并進一步探索循環腫瘤細胞上的c-Myc、CD-47和PD-L1以及循環單核細胞上的SIRPα表達。

4.4 雙特異性抗體

TG-1801是一種新型、首創、抗CD47/CD19的雙特異性抗體，TG-1801可有效提供抗B細胞腫瘤吞噬的活性，同時避免與之前靶向CD47通路藥物相關的毒性問題。此外，CD47和CD19的共同靶向性不僅增強了預期安全性，而且通過保留其IgG1 Fc的功能，TG-1801還可以誘導ADCC的發生，提供抗腫瘤活性的第二機制。主要開發用于治療復發性或難治性B細胞淋巴瘤患者。正在進行多中心Ⅰ期研究，旨在評價TG-1801的安全性、藥代動力學、療效和推薦的Ⅱ期劑量。此外，中國自主研發的抗PD-1/CD47雙特異抗體新藥也正在進行Ⅰ期臨床試驗（NCT04097769）。

6 結論

CD47作為非常有前景的免疫治療靶點，目前已經有一些靶向CD47-SIRPα的抗腫瘤新藥已經在實體瘤和血液系統腫瘤中看到了較好的抗腫瘤活性，并且在聯合靶向藥物、免疫靶向藥物和放療等領域也看到了初步的安全性和療效，很可能將在腫瘤治療中發揮重要的作用。未來需要更好地了解CD47誘導信號在調節免疫中的作用，為開發更有效的癌癥免疫療法提供思路。