單細胞分析微環境與髓母細胞瘤預后的關系

羅文欽，楊茹

髓母細胞瘤是兒童中最常見的腦腫瘤之一，是一種發生在小腦蚓部小細胞分化不良的惡性腫瘤[1-2]，其生物學機制尚未完全闡明。在髓母細胞瘤中，微環境的細胞分群與髓母細胞瘤預后關系的研究更是鮮有報道。本課題組前期已采用轉基因小鼠Patched＋/-髓母細胞瘤模型，研究了髓母細胞瘤發生早期Sonic hedgehog（SHH）信號通路對小腦顆粒神經元前體細胞（granule neuron progenitor，GNP）分裂模式的調控作用[3]，并發現對稱不對稱分裂關鍵調控因子和抑癌基因Trim32通過結合并降解SHH信號通路中的關鍵因子Gli1[4]，從而抑制髓母細胞瘤的進展。隨著單細胞測序技術的迅速發展，為研究腫瘤微環境的細胞分群與髓母細胞瘤的關系提供了技術支撐。

世界衛生組織（World Health Organization，WHO）將髓母細胞瘤歸類為Ⅳ級腫瘤。隨著分子生物學的發展，基于高通量的基因測序、基因表達譜及基因拷貝數異常的分析，WHO（2016年）中樞神經系統腫瘤分類將髓母細胞瘤分為4 種不同的亞型：SHH型、WNT型、3型（Group3）和4型（Group4）[5]。其中，SHH型髓母細胞瘤是目前研究最廣泛的一種分型，其根據SHH信號轉導通路命名[6]。有研究采用譜系追蹤技術證實，SHH型髓母細胞瘤是由特異性表達Math1基因的GNP惡性轉化而來[7-8]。GNP的增殖受SHH信號通路的調控，在小腦發育早期，浦肯野纖維細胞分泌SHH糖蛋白，與GNP表面的Patched受體結合，解除其對下游信號接收器Smoothened（SMO）蛋白的抑制作用，激活Gli家族的轉錄因子（Gli1等），促進下游與增殖相關基因的轉錄表達，從而誘導GNP大量增殖[9]。當編碼Patched受體和SMO蛋白的基因發生突變，SHH信號通路被異常激活，可導致GNP惡性轉化形成髓母細胞瘤。其中，Patched基因純合突變小鼠，因神經系統、心臟和其他器官缺陷，在胚胎發育期即死亡，而Patched基因雜合突變小鼠（Patched＋/-）在出生3～6個月后，14%～20%的小鼠可產生髓母細胞瘤，是研究髓母細胞瘤的一個重要模型。Math1基因啟動子驅動的Cre重組酶轉基因小鼠（Math1-Cre/SmoM2，M-Smo）可使SMO基因的突變特異地發生在GNP，小鼠在出生12 d（P12）后100%會發生髓母細胞瘤[10]，也是研究髓母細胞瘤的一個重要模型。

近年來，隨著單細胞RNA測序技術（singlecell RNA sequencing，scRNA-seq）的蓬勃發展，通過該技術可以從單細胞水平獲得基因表達譜，了解細胞的異質性，發現新的細胞類型、相關細胞的標志基因及新細胞類型的潛在功能[11-14]。有研究利用scRNA-seq技術，探索小鼠出生前后小腦細胞的差異，通過與髓母細胞瘤患者RNA表達數據的比對分析，證實腫瘤細胞在基因表達譜上更類似于小鼠出生后早期的GNP，為臨床診斷和治療提供了新的角度[15-16]。另有研究表明，M-SMO轉基因小鼠形成的髓母細胞瘤在采用SMO蛋白抑制劑維莫德吉（vismodegib）治療后，增殖活躍的顆粒神經元前體細胞樣（GNPlike）腫瘤細胞所占的比例明顯降低，通過比較治療組和對照組的腫瘤細胞的基因表達差異，即可找出治療腫瘤干細胞的靶基因[10]。然而，這些髓母細胞瘤的scRNA-seq研究仍旨在探索腫瘤細胞本身，而忽視對腫瘤微環境細胞的探索。

腫瘤微環境在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用，與腫瘤生長、轉移和耐藥等行為密切相關[17-18]。有研究表明，腫瘤浸潤性免疫細胞如淋巴細胞能夠影響患者的預后，并且可以預測患者對化療的敏感性[19]。在髓母細胞瘤中，有研究指出SHH型腫瘤微環境較其他3種類型的腫瘤微環境可富集更多的腫瘤相關性巨噬細胞，提示這類細胞是靶向治療的關鍵對象[20]；此外，星形膠質細胞的存在可促進髓母細胞瘤的發生和發展[21]，上述研究皆提示，靶向干預腫瘤微環境是治療髓母細胞瘤的熱點。然而，當前在髓母細胞瘤中卻依然缺乏靶向干預腫瘤微環境的有效手段，可能是因為缺乏對髓母細胞瘤微環境的全面認識。因此，認識髓母細胞瘤微環境的細胞分群，有助于探討不同微環境細胞與髓母細胞瘤患者預后的關系，推測其對腫瘤發生和發展的影響，并揭示其作為靶向治療目標的潛能。

本研究旨在整合正常小鼠和髓母細胞瘤小鼠模型，包括使用vismodegib治療腫瘤小鼠的scRNA-seq數據[10]，探討不同狀態下微環境細胞比例的變化情況。結合患者的RNA表達數據[22]進行分析，揭示不同微環境細胞群與患者預后及臨床特征之間的關系，推測不同微環境細胞群對腫瘤發生和發展的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

用于單細胞測序的5只C57BL/6J小鼠分別為3只Patched＋/-轉基因小鼠和2只野生型（wild-type，WT）小鼠。Patched＋/-轉基因小鼠購自美國Jackson實驗室（貨號：003081），WT小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004]。髓母細胞瘤樣本取自Patched＋/-轉基因小鼠培育50周后形成的腫瘤，WT小鼠的小腦組織取自出生后第7天（P7）以及第11天（P11）的小鼠。本研究中使用的小鼠均飼養在上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級動物中心[動物飼養許可證號：SYXK（滬）2016-0012]。飼養溫度和濕度統一控制，所有動物實驗方案都通過仁濟醫院動物研究倫理委員會的批準。

1.2 試劑及儀器

DMEM培養液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公 司，2×Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。EDTA溶液、TAE緩沖液和Tris-HCl（pH值＝5.5）緩沖液購自生工生物工程（上海）股份有限公司。胰蛋白酶、膠原酶、DNA酶和淋巴細胞分離液購自中國碧云天生物技術公司。

PCR儀（型號：T100TMThermal Cycler）為美國Bio-Rad公司產品，CO2培養箱（型號：Thermo3111）為美國Thermo Fish公司產品，冷凍離心機（型號：Centrifuge 5424R）為購自德國Eppendof公司產品。

10×Genomics是一個美國基因測序技術服務平臺，主要為用戶提供Chromium系統，以單個細胞分辨率復制數字分析，適用于基因表達譜分析、單細胞免疫分析、外顯子組測序和基因組測序等領域。本研究采用的10×Genomics平臺服務由晶能生物技術（上海）有限公司提供，使用的RNA測序儀是美國Illumina公司的NovaSeq 6000測序儀。

1.3 單細胞RNA測序流程

本研究中的單細胞RNA測序流程包括單細胞懸液制備、建庫以及上機測序，詳細流程參見10×Genomics官 網https://www.10×genomics.com。流程如下：（1）制備單細胞懸液，將小腦組織轉移至裝有1 mL DMEM培養液的1.5 mL離心管中，先加入100×膠原酶和100×DNA酶15 μL，隨后加入470 μL DMEM培養液補齊至1.5 mL并蓋緊離心管，置于37 ℃培養箱中，期間每隔10 min上下顛倒搖晃1 min；1 h后從培養箱內拿出，用200 μL槍頭輕柔吹打2～3 min，350×g離心5 min，除去上清液。隨后加入含EDTA的1 mL胰蛋白酶重懸沉淀，采用200 μL槍頭輕柔吹打使細胞散開，繼續置于37 ℃培養箱中消化10 min；之后350×g離心5 min，除去上清液。用600 μL含10% FBS的DMEM培養液重懸沉淀，并將槍頭插入管底，緩慢加入300 μL淋巴細胞分離液，此時離心管內樣本分為2層，上層為細胞懸液，下層為淋巴細胞分離液，注意不要晃蕩離心管，保持液面分層。之后800×g離心20 min，注意此時需使用水平轉子，并設置離心機加速度和減速度均為2，防止上下層溶液相混。離心結束后可發現離心管中樣本分為3層，最下層為紅細胞和死細胞碎片，中間層是淋巴細胞分離液和少量的活細胞，最上層主要為活細胞懸液，即為實驗需要的單細胞懸液。（2）建庫，本研究采用基于10×Genomics的ChromiumTMSingle Cell 3’ Solution進行建庫，該方法能夠一次性分離、標記500～10 000個單細胞，并進行無偏的3’端基因表達信息的建庫，具有操作簡捷，分辨率高，能夠比較單個細胞間的轉錄組差異等優點。（3）上機測序，構建好的文庫通過NovaSeq 6000（Illumina）測序儀進行測序，測序數據量為每個樣品約400 M reads。

本研究的單細胞RNA數據已上傳至基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO），具體網址為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ac-c.cgi?acc＝GSE156633。

1.4 M-SMO轉基因小鼠和髓母細胞瘤臨床標本

M-SMO轉基因小鼠的單細胞RNA數據從GEO數據庫（GSE129730）中下載，共包括10只M-SMO轉基因小鼠形成的髓母細胞瘤樣本。10只小鼠被隨機分為2組：一組使用SMO抑制劑維莫德吉（vismodegib）進行治療，一組使用空載體（vector）進行對照研究。該數據庫對應的研究已證實，與對照組相比，vismodegib治療組小鼠髓母細胞瘤中GNP-like腫瘤細胞所占百分比明顯降低，表明藥物治療對腫瘤細胞有效。

髓母細胞瘤患者的RNA表達數據從GEO數據庫（GSE124814）中下載，該數據共整合了23個數據集中SHH型的髓母細胞瘤患者的RNA表達數據，包括405例患者，臨床信息詳見表1。

表1 GEO數據庫（GSE124814）獲得的405例SHH型髓母細胞瘤患者的臨床特征Table 1 The characteristics of 405 patients with SHH medulloblastoma from Gene Expression Omnibus (GEO)dataset (GSE124814)(N＝405)

1.5 單細胞RNA數據降維分析

本研究采用R語言軟件Seurat程序包的單細胞分析流程對scRNA-seq數據矩陣進行分析。（1）創建Seurat對象：采用Seurat程序包中Read10×函數讀取scRNA-seq數據矩陣，創建Seurat對 象；（2）數據質控（quality check，QC）：采用細胞特異性表達的基因去除紅細胞等不在研究范圍內的細胞，設置所有基因在每個細胞中總表達量的最低閾值，進一步過濾低質量細胞；（3）對數據進行標準化（Normalize Data）：采用Seurat程序包的Normalize Data函數，對每個樣本數據進行全局縮放歸一化（globalscaling normalization），即用總表達量對每個單元格的基因表達量進行歸一化，然后將其乘以縮放因子（默認為10 000），對結果進行對數轉換；（4）可視化細胞分群：采用無監督方法對數據進行降維分析，基于數據中2 000個高可變基因（highly variable genes，HVG）進行主成分分 析（principal component analysis，PCA），設置參數“維度（dims）”為30，進行細胞聚類分群，最后采用t分布隨機鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）或統一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）算法體現可視化細胞分群結果。t-SNE和UMAP算法都是將細胞分群以二維平面的形式呈現，分別以t-SNE_1或UMAP_1作為橫坐標以及t-SNE_2或UMAP_2作為縱坐標。

1.6 細胞類型識別

參閱參考文獻中相應細胞的標志基因[23]，對細胞分群進行命名：Cd3d和Cd3e是T細胞（T cells）的標志基因，Col1a1是成纖維細胞（fibroblasts）的標志基因，Aqp4和aldh1l1是星形膠質細胞（astrocytes）的標志基因，Olig1和Olig2是少突膠質細胞（oligodendrocytes）的標志基因；Aif1和Cd68是小膠質細胞（microglia）的標志基因；Cdh5和Cldn5是內皮細胞（endothelial cells）的標志基因。采用Seurat程序包中的FeaturePlot功能展示標志基因在單細胞聚類圖中的表達情況。

1.7 微環境細胞整合分析

取生長至第7天和第11天的2只WT小鼠的小腦組織，以及3只Patch＋/-轉基因小鼠形成的髓母細胞瘤樣本，進行scRNA-seq，并提取微環境細胞進行降維分析。從GEO數據庫（GSE129730）下載采用vismodegib治療組以及空載體（vector）處理的對照組M-SMO轉基因小鼠腫瘤的scRNA-seq數據矩陣，并對微環境細胞進行降維分析。對2組數據中微環境細胞的scRNA-seq數據矩陣進行整合分析（integration analysis），用于綜合分析比較腫瘤與正常小腦組織中微環境細胞數量的差異，并且比較vismodegib治療組與對照組之間微環境細胞數量的差異。

1.8 基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）

采用Seurat程序包對不同細胞群進行差異表達基因分析（differential gene expression analysis，DEG），選取差異表達P＜0.05且差異倍數（fold change，FC）即|log2FC|＞0.25的基因，作為每種細胞類型的特異性表達基因集（gene set），分別定義為T細胞相關基因（T cell-related gene）、小膠質細胞相關基因（microglia-related gene）、成纖維細胞相關基因（fibroblast-related gene）、星形膠質細胞相關基因（astrocyte-related gene）、少突膠質細胞相關基因（oligodendrocyterelated gene）和內皮細胞相關基因（endothelial cell-related gene）；采用GSVA程序包對髓母細胞瘤患者的RNA表達數據分別計算上述基因集的基因得分，微環境細胞相關基因的GSVA得分即表示微環境相關基因的表達水平，同時也可用于表示微環境細胞的富集程度。

1.9 生存分析

采用GSVA程序包對髓母細胞瘤患者的RNA表達數據計算T細胞相關基因、小膠質細胞相關基因、成纖維細胞相關基因、星形膠質細胞相關基因、少突膠質細胞相關基因和內皮細胞相關基因的得分；使用survminer程序包的surv_cutpoint函數尋找GSVA得分的分組閾值，并根據這個閾值把GSVA得分分為得分高（high）和得分低（low）2組，最后采用Kaplan-Meier法分析2組患者的總生存（overall survival，OS）時間。

1.10 細胞比例分析

計算不同微環境細胞群中腫瘤和正常樣本的構成比，采用χ2檢驗比較2者之間的差異，隨后計算不同微環境細胞群中vismodegib治療組和對照組樣本的構成比，并進行χ2檢驗；在SHH型髓母細胞瘤患者RNA數據中對所有微環境細胞相關基因得分進行聚類分析，將405例患者分為A組和B組，以每一例患者RNA數據中所有微環境細胞相關基因得分的最大值對應的微環境細胞類型作為該患者的主要微環境細胞成分，計算2組患者中主要微環境細胞類型所占的比例，使用circlize程序包制作弦狀圖展示2組患者的微環境細胞比例，并采用χ2檢驗比較2組的細胞比例差異。

1.11 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.00統計學軟件對數據進行統計學分析。采用χ2檢驗比較不同分組之間的細胞比例差異；生存分析采用Kaplan-Meier法，進行log-rank檢驗；采用COX風險比例回歸模型進行髓母細胞瘤患者預后的多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單細胞測序及單細胞分析流程

解剖獲得Patched＋/-轉基因小鼠培育50周后形成的髓母細胞瘤和正常小鼠的小腦（WT cerebellum）組織，進行單細胞RNA測序。對獲得的所有微環境細胞進行降維分析，一共捕獲2 077個微環境單細胞（圖1A）。從GEO數據庫（GSE129730）中下載對M-SMO轉基因小鼠培育形成的髓母細胞瘤中的微環境細胞進行單細胞降維分析而獲得的1 781個微環境單細胞（圖1B）。隨后對2個微環境單細胞RNA數據矩陣進行整合分析，共獲得3 859個微環境單細胞（圖1C）。由于采用的小鼠模型都是髓母細胞瘤的動物模型，因此獲得的微環境單細胞可用于描述小鼠髓母細胞瘤微環境的細胞分群情況。

Fig.1 Workflow for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and analysis of microenvironment.A:Workflow for tissue collection,single-cell digestion,sequencing and analysis of microenvironment in two wild-type (WT) mice cerebellum and three Patched+/- medulloblastoma mouse models.B: Analysis of microenvironment in Math1-Cre/SMOM2 (M-SMO) medulloblastoma mouse models from GSE129730 dataset.C: Integration analysis of microenvironment from two scRNA-seq datasets.圖1 小鼠髓母細胞瘤的單細胞測序流程以及微環境的單細胞分析

2.2 髓母細胞瘤小鼠模型和WT小鼠小腦組織微環境細胞圖譜

對WT小鼠的小腦組織和SHH型髓母細胞瘤小鼠模型腫瘤組織的微環境細胞進行整合分析，共獲得3 859個細胞，降維分析結果顯示微環境細胞一共分為12個細胞群（圖2A）。根據細胞標志基因的表達情況（圖2B），將12個細胞群分別定義為T細胞、成纖維細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞和內皮細胞。隨后的單細胞基因表達圖（Feature Plot）（圖2C）顯示，標志基因確實特異地表達在對應的微環境細胞類型中，Cd3d基因特異地表達在T細胞中，Col1a1基因特異地表達在成纖維細胞中，Aqp4基因特異地表達在星形膠質細胞中，Olig1基因特異地表達在少突膠質細胞中，Cd68基因特異地表達在小膠質細胞中，而Cldn5基因特異地表達在內皮細胞中，表明細胞類型定義準確。此外，分群結果中檢測到T細胞這個分群，這在以往小鼠小腦的單細胞測序研究中并未出現[15-16,23]。

Fig.2 Single-cell transcriptome profiling of microenvironment in Sonic Hedgehog (SHH)medulloblastoma mouse models and wild-type (WT) cerebellum.A: Uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization of all 3 859 microenvironmental cells from two datasets with cells colored according to the corresponding cell types;x axis and y axis indicate two dimensions.B: Dot plot for expression of marker genes in microenvironmental cell types.The color represents average expression of marker genes in each cell type,and the size indicates the proportion of cells expressing marker genes.C:Feature Plot showing the signature gene expression of each microenvironmental cell type in the form of UMAP;x axis and y axis indicate two dimensions.圖2 采用UMAP算法獲得的髓母細胞瘤小鼠模型和WT小鼠小腦微環境細胞可視化分群圖譜

2.3 比較不同類型樣本中微環境細胞數量的差異

對樣本來源和細胞構成比例進行分析。對腫瘤和正常樣本的分析結果（圖3A）顯示，T細胞和內皮細胞只出現在腫瘤樣本中。此外，腫瘤較正常樣本具有更多的少突膠質細胞和小膠質細胞（P＜0.001），具有更少的星形膠質細胞（P＜0.001）。此外，對vismodegib治療組和空載體（vector）對照組的分析結果（圖3B）顯示，與采用空載體（vector）處理的對照組相比，采用vismodegib治療腫瘤后，T細胞群只富集在治療組的樣本中（P＜0.001），并且治療組樣本較對照組樣本具有更多的成纖維細胞和小膠質細胞，及更少的內皮細胞和少突膠質細胞（P均＜0.001）。已知SHH型髓母細胞瘤小鼠模型在使用vismodegib治療后，增殖活躍的腫瘤干細胞所占比例明顯下調，表明治療有效。本研究中vismodegib治療后T細胞、成纖維細胞和小膠質細胞數量的增加可能發揮著抑制腫瘤發生和發展的功能，而內皮細胞和少突膠質細胞所占比例下調可能發揮促進腫瘤發生和發展的功能。

Fig.3 Comparison of the proportion of microenvironmental cell types in different types of samples.A:Uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization of microenvironmental cell types in different microenvironment sources (tumor vs normal);x axis and y axis indicate two dimensions.B: Bar plot showing the cell proportion of microenvironmental cell types in different microenvironment sources(tumor vs normal) [P＜0.000 1 (chi-square test)].C: UMAP visualization of microenvironmental cell types in different treatment strategies (vismodegib vs vector);x axis and y axis indicate two dimensions.D: Bar plot showing the cell proportion of microenvironmental cell types in different treatment strategies (vismodegib vs vector) [P＜0.001 (chi-square test)].圖3 采用UMAP圖展示不同來源樣本[腫瘤和正常組織的構成比（A）以及vismodegib治療組和對照組（B）]的微環境細胞分群情況以及微細胞群的構成比

2.4 腫瘤微環境細胞群對髓母細胞瘤患者預后的影響

為進一步探討微環境細胞群對腫瘤發生和發展的影響，對405例SHH型髓母細胞瘤患者的RNA表達數據進行GSVA分析，獲得微環境細胞群相關基因的GSVA得分，隨后基于GSVA得分分析患者的OS期。結果顯示，高表達小膠質細胞和成纖維細胞相關基因的患者OS期較長（圖4A和4B，P均＜0.05），結合vismodegib治療后腫瘤小鼠中小膠質細胞和成纖維細胞比例增加的結果，表明這2種細胞的存在可能抑制腫瘤的發生和發展。同樣地，本研究中發現高表達少突膠質細胞相關基因患者OS期的較短（圖4C，P＝0.002 8），結合vismodegib治療后腫瘤小鼠中少突膠質細胞比例降低的結果，表明少突膠質細胞的存在可能促進腫瘤的發生和發展。本研究中還發現，高表達星形膠質細胞（圖4D）、內皮細胞（圖4E）和T細胞相關基因（圖4F）患者的OS期并沒有出現明顯的差異，因此未來尚需通過進一步的研究，探討這3個相關基因對腫瘤發生和發展的影響。

Fig.4 The correlation between microenvironmental cell type-related genes (microglia-related gene,fibroblasts-related gene,oligodendrocytes-related gene,astrocytes-related gene,endothelial cells-related gene and T cells-related gene) scores and overall survival (OS) of medulloblastoma patients was analyzed by Kaplan-Meier method.圖4 Kaplan-Meier法分析微環境細胞相關基因得分和髓母細胞瘤患者OS期的相關性

2.5 腫瘤微環境細胞富集程度與患者臨床特征之間的關系

為了探討腫瘤微環境細胞富集程度與患者臨床特征之間的關系，本研究中首先以微環境細胞相關基因的GSVA得分表示患者微環境細胞群的富集程度。通過對微環境細胞群富集程度的熱圖（圖5A）聚類分析顯示，405例患者被分為2組，A組有患者186例，B組有患者219例；A組患者主要有富集內皮細胞、成纖維細胞和小膠質細胞，B組患者主要有富集星形膠質細胞和少突膠質細胞。對2組患者的OS期進行分析，結果（圖5B）顯示，A組患者的預后較好，而B組患者的預后較差（P＝0.004），結合A組患者的微環境細胞富集特征（圖5A），進一步證實成纖維細胞和小膠質細胞具有抑制腫瘤發生和發展的作用，而少突膠質細胞在髓母細胞瘤中則可能具有促進腫瘤發生和發展的作用。

隨后對所有患者臨床特征進行分析。結果（圖5C）顯示，B組中具有更多的未成年患者（＜18歲）（P＜0.001），并且組織病理學上更多地表現為大細胞和間變型（large cell and anaplastic，LCA）（P＜0.001）。根據以往報道[24-25]，青少年患者組織病理學常表現為LCA型，而LCA型患者的臨床預后極差，這可能進一步佐證了為何B組患者預后更差的結論。

Fig.5 The correlation between enrichment level of microenvironmental cell types and the clinical characteristics of patients with medulloblastoma.A: Heatmap showing the gene set variation analysis (GSVA)scores indicating the enrichment level of microenvironmental cell types in human SHH medulloblastoma patients from Gene Expression Omnibus (GEO): GSE124814 with annotation of characteristics including age,histology,metastatic stage and gender.B: Survival curves of Group A and Group B were analyzed by Kaplan-Meier method (log-rank test).C: Bar plot showing the proportion of clinical characteristics in Group A and Group B (chi-square test).LCA: Large cell and anaplastic;MBEN: Medulloblastoma with extensive nodularity;NOS: No-molecular study;M1: Distant metastasis;M0: Without metastasis.圖5 腫瘤微環境細胞富集程度與髓母細胞瘤患者臨床特征之間的關系

2.6 腫瘤微環境細胞共同調控髓母細胞瘤的發生和發展

腫瘤微環境細胞通過相互作用共同調控腫瘤發生和發展的進程，為探討微環境細胞群對髓母細胞瘤患者的共同調控機制，將每位患者GSVA得分的最大值對應的細胞類型定義為患者具有的主要微環境細胞成分，對A組和B組患者的主要微環境細胞成分進行組成分析（圖6A），結果顯示A組患者主要包含小膠質細胞、成纖維細胞和內皮細胞，相反B組患者主要包含少突膠質細胞和星形膠質細胞（P＜0.001），與圖5A的結果一致。相關性分析結果（圖6B）顯示，小膠質細胞，成纖維細胞和內皮細胞的相關性更高（r均＞0.8），而少突膠質細胞和星形膠質細胞的相關性更高（r均＞0.4），提示不同細胞群之間是共同調控腫瘤發生和發展過程的。結合生存分析結果，小膠質細胞和成纖維細胞可能是通過相互作用共同抑制腫瘤的進展，因此A組患者的預后較好。盡管少突膠質細胞和星形膠質細胞相關性很高，但是當富集為星形膠質細胞時，患者OS期之間的差異無統計學意義；由此推測，可能是由于少突膠質細胞發揮了促進腫瘤進展的作用，從而揭示了B組患者預后較差的原因。

COX多因素風險回歸模型分析結果（表2）顯示，少突膠質細胞相關基因的GSVA得分是髓母細胞瘤患者生存期的獨立危險因素，其得分越高，患者的OS期越短[風險比（hazard ratio，HR）＝1.601，95%可信區間（confidence interval，CI）為1.011～127.829，P＝0.049]；此外協變量中，發生轉移也是患者OS期的危險因素。相反，成纖維細胞相關基因的GSVA得分越高（表3），患者的OS期越長（HR＝0.066，95%CI為0.013～0.331，P＜0.001）；協變量中，腫瘤不發生轉移是患者OS期的保護因素。綜上所述，提示當腫瘤微環境富集少突膠質細胞時，腫瘤更容易發生轉移，反之當腫瘤微環境富集成纖維細胞時，腫瘤則不易發生轉移。

表3 多因素COX風險模型分析成纖維細胞、小膠質細胞和內皮細胞相關基因得分與髓母細胞瘤患者OS期的相關性Table 3 Multivariate COX proportional-hazards model analysis of the relationship between fibroblast-,microglia-and endothelial cell-related gene scores and the overall survival (OS) of patients with medulloblastoma

Fig.6 The co-effects of microenvironmental cell types on the progression of medulloblastoma.A: The proportion of microenvironmental cell types in Group A and Group B (patients with medulloblastoma having annotations colored according to the corresponding cell types (chi-square test).B: The correlation between microenvironmental cell types based on cell type-related gene scores.圖6 腫瘤微環境細胞在腫瘤發生過程中的共同作用

表2 多因素COX風險模型分析星形膠質細胞和少突膠質細胞相關基因得分與髓母細胞瘤患者OS期的關系Table 2 MultivariateC OX proportional-hazards model analysis of the relationship between astrocyte-and oligodendrocyte-related gene scores and the overall survival (OS) of patients with medulloblastoma

3 討論

髓母細胞瘤是兒童中最常見的中樞神經系統腫瘤，約占中樞神經系統腫瘤的16%～25%[26]。目前治療髓母細胞瘤的方式首選手術治療，術后輔以放化療。然而過度放、化療對兒童其他器官的損害極大，腫瘤遠期生存率仍然很差[27]。所以，探索影響髓母細胞瘤發生和發展的機制，以尋求新的治療方向，顯得尤為迫切。

許多研究已經表明，腫瘤微環境細胞在腫瘤的發生和發展過程中起著重要作用。SHARMA等[28]發現，肝癌中腫瘤相關性巨噬細胞可通過分泌細胞因子等方式與腫瘤細胞相互作用，從而拮抗腫瘤的生長。然而，小膠質細胞作為中樞神經系統中主要的巨噬細胞群，其對腫瘤發生和發展的影響仍存在爭議[18]。其他研究表明，腫瘤微環境細胞可預測腫瘤對治療的敏感性。GOODEN等[19]發現，當腫瘤浸潤性淋巴細胞如CD3＋T細胞的比例增加時，患者的預后更好，提示這些患者對治療更敏感。MAYNARD等[29]發現，化療敏感的肺癌患者中，T細胞的比例高于化療耐受的患者，提示T細胞的存在可改善患者的預后。因此，靶向干預腫瘤微環境細胞可能有助于抑制腫瘤的進展，改善腫瘤患者的預后。

本研究通過對正常小鼠和腫瘤小鼠微環境的scRNA-seq數據的整合分析，首次描述了髓母細胞瘤小鼠模型中可能存在的微環境細胞類型，并首次比較了腫瘤和正常小鼠、腫瘤小鼠治療組和對照組之間微環境細胞的數量變化。隨后分析微環境細胞相關基因表達水平和患者預后的關系，發現成纖維細胞和小膠質細胞在腫瘤微環境中的富集可改善患者的預后。此外，患者的臨床特征分組也顯示，富集這2類細胞的分組患者預后更好，結合細胞相關性分析結果，提示這兩類細胞可能起到共同抑制腫瘤進展的作用。已有研究表明[30]，成纖維細胞可增強膀胱癌細胞的增殖和轉移能力，從而促進膀胱癌的進展。而本研究結果顯示，成纖維細胞可改善髓母細胞瘤患者的預后，多因素COX風險模型進一步顯示成纖維細胞相關基因表達水平及腫瘤不發生轉移均為患者OS期的保護因素，可見成纖維細胞可能阻礙髓母細胞瘤發生轉移，從而抑制其進展。作為小腦中巨噬細胞的主要類型，小膠質細胞與腫瘤相關性巨噬細胞的作用一致，即能夠抑制腫瘤的發生和發展。本研究還發現少突膠質細胞的存在，可導致患者的預后較差，并促進腫瘤的轉移，這在以往的報道中較少出現。

近年來有關髓母細胞瘤的scRNA-seq研究已經詳細地描述了腫瘤細胞之間的異質性，并通過結合患者RNA表達數據分析，闡明了不同腫瘤細胞分群對患者預后的影響[15-16]。然而，是這些研究都忽視了對微環境細胞的分析，因此本研究首次利用小鼠scRNA-seq數據著重探討微環境細胞在不同狀態下的數量變化，包括比較腫瘤和正常小鼠、腫瘤小鼠治療組和對照組的細胞數量變化的情況。為了進一步研究不同微環境細胞分群對患者預后的影響，本研究還從GEO數據庫（GSE124814）中下載了整合23個數據集中共405例SHH型髓母細胞瘤患者的RNA表達數據及臨床資料進行分析，最終結果提示成纖維細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞對患者預后有顯著影響，表明這3類細胞在髓母細胞瘤的靶向干預治療中具有重要意義，但關于這3類細胞調控髓母細胞瘤發生和發展的具體功能和機制還有待進一步探討。

綜上所述，腫瘤微環境中的成纖維細胞和小膠質細胞可改善患者的預后，抑制髓母細胞瘤的發生和發展；而少突膠質細胞可使患者的預后更差，促進髓母細胞瘤的進展。因此，靶向干預這3類細胞對腫瘤細胞的調控機制，可能有助于抑制腫瘤的進展，改善腫瘤患者的預后。