銀杏總黃酮調(diào)控動(dòng)脈硬化大鼠自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

王穎超

(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810016)

0 引言

自噬可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)自噬嚴(yán)重會(huì)引起細(xì)胞死亡，自噬發(fā)生時(shí)，損傷的細(xì)胞成分可以被清除，進(jìn)而延遲動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，使得內(nèi)皮細(xì)胞抵抗炎癥分子，氧化應(yīng)激等，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡和壞死的產(chǎn)生[5-7][10-11]。銀杏總黃酮是中藥材銀杏的主要有效成分，通過(guò)以往的相關(guān)研究表明[1-4]，銀杏總黃酮在維護(hù)心血管氧化應(yīng)激、清除體內(nèi)自由基等作用方面具有一定作用，被譽(yù)為心臟病的維護(hù)者。有專門研究已經(jīng)證實(shí)白藜蘆醇通過(guò)p38通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生進(jìn)而延緩動(dòng)脈粥樣硬化[11]，故本研究以AS大鼠模型為研究對(duì)象，以白藜蘆醇為陽(yáng)性藥物對(duì)照來(lái)探討銀杏總黃酮對(duì)AS大鼠主動(dòng)脈自噬相關(guān)基因beclin-1及LC3表達(dá)水平的影響，以闡明銀杏總黃酮抗動(dòng)脈粥樣硬化的原理，為銀杏的臨床應(yīng)用有著科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

雄性SD大鼠，體重160g至190g，由甘肅醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。銀杏總黃酮由上海源葉生物公司提供，總黃酮度56.2%；白藜蘆醇由上海基兔實(shí)業(yè)公司提供，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、丙二醛試劑盒由維百瑞生物公司提供；beclin-1及LC3的 Elisa試劑盒等購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建動(dòng)物模型

采用SD大鼠60只。隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(CON)、模型對(duì)照組(AS)、白藜蘆醇組(Res)、銀杏總黃酮低、中、高劑量組(YXZ-L、YXZ-M、YXZ-H)。CON組給予注射生理鹽水，其余組按照30mg/kg標(biāo)準(zhǔn)量腹腔注射維生素D3，以及高脂飼料喂食。CON組和AS組則采用等體積生理鹽水灌胃，同時(shí)給予銀杏總黃酮按照125、250、500 mg/kg 的劑量灌胃，白藜蘆醇組則以150mg/kg灌胃。

1.2.2 主動(dòng)脈HE染色

SD大鼠處死后，固定采用4%福爾馬林液，脫水及包埋切片，使用HE染色后觀察大鼠內(nèi)皮損失狀況。

1.2.3 氧化指標(biāo)測(cè)定

詳細(xì)遵照試劑盒說(shuō)明書方法，測(cè)定血漿中SOD、GSH-Px 活性和CAT、MDA活性變化。

1.2.4 主動(dòng)脈beclin-1及微管相關(guān)蛋白LC3表達(dá)測(cè)定

取主動(dòng)脈，按照elisa試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管內(nèi)皮損傷改變

由HE染色結(jié)果可知：CON組血管內(nèi)皮無(wú)損失，表面無(wú)炎性細(xì)胞且無(wú)脂質(zhì)沉積，未見管腔狹窄；模型對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)彈力膜消失或損壞，血管管腔增厚，泡沫細(xì)胞形成，脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，血管結(jié)構(gòu)已經(jīng)欠完整；銀杏總黃酮低劑量和銀杏總黃酮中劑量組主動(dòng)脈內(nèi)皮無(wú)明顯損傷，僅見血管腔輕微增厚，輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕微脂質(zhì)沉積，泡沫細(xì)胞罕見；銀杏總黃酮高劑量組和白藜蘆醇組血管內(nèi)膜有所輕微增厚，內(nèi)皮細(xì)胞水腫不明顯，僅見少量?jī)?nèi)皮層撕裂，脂質(zhì)沉積較少，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞(見圖1)。

圖1 AS大鼠主動(dòng)脈病理切片[HE染色、(400)]，A為正常對(duì)照組，B為模型對(duì)照組，C為銀杏總黃酮低劑量組，D為銀杏總黃酮中劑量組，E為銀杏總黃酮高劑量組，F(xiàn)為白藜蘆醇組；圖片箭頭所指為血管內(nèi)膜

2.2 氧化應(yīng)激的差異

CON組比AS組GSH-Px、SOD、CAT的表達(dá)活性均顯著下降(P<0. 01)，MDA表達(dá)含量顯著提升(P<0. 01)；與AS組比較，YXZ-L組MDA表達(dá)含量下降(P<0. 05)，YXZ-M組SOD、GSH-Px 表達(dá)活性提升(P<0. 05)，MDA 含量下降(P<0. 05)，YXZ-H組和白藜蘆醇組GSH-Px、SOD、CAT 表達(dá)量均提升(P<0. 01)，MDA表達(dá)含量下降(P<0. 01)；證明銀杏總黃酮和白藜蘆醇都延緩動(dòng)脈粥樣硬化，機(jī)制是降低AS大鼠血清中MDA的含量，提升AS大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT的表達(dá)(見表1)。

表1 銀杏總黃酮對(duì)AS大鼠GSH-Px、SOD、CAT 和 MDA等因子表達(dá)的影響(±s)

表1 銀杏總黃酮對(duì)AS大鼠GSH-Px、SOD、CAT 和 MDA等因子表達(dá)的影響(±s)

注：*與正常對(duì)照組相比較，P<0.01；**：與粥樣硬化組相比較，P<0.05。

Group n SOD(U/mL) GSH-Px(U/mL) CAT(U/g) MDA(μmol/L)Control 10 71.13±10.39 81.28±21.39 212.95±31.86 6.72 ±1.84 Model 10 51.53±10.16* 33.52±10.29* 112.28±21.64* 11.18±3.46*Res YXZ-L 10 10 73.11±745**56.52±7.84**53.16±11.31**43.59±10.38**152.98±24.75**131.64±24.64**8.19 ±2.14**9.21±2.16**YXZ-M 10 70.53±11.7** 44.78±12.35** 131.52±24.92** 7.49±3.94**YXZ -H 10 74.35±11.6** 59.76±11.21** 161.27±31.13** 9.45±1.14**

2.3 beclin-1及LC3蛋白表達(dá)

正常對(duì)照組beclin-1與 LC3蛋白的表達(dá)極低，而模型對(duì)照組beclin-1與 LC3蛋白表達(dá)有所升高，但并不明顯(P<0.01)；銀杏總黃酮組和白藜蘆醇組自噬程度均高于正常對(duì)照組，并較模型組表達(dá)也明顯升高(P<0.01)。提示銀杏總黃酮延緩動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制是上調(diào)AS大鼠beclin-1與 LC3蛋白的表達(dá)(見圖2)。

圖2 ELISA檢測(cè)AS大鼠主動(dòng)脈beclin-1與 LC3蛋白的表達(dá)

3 討論

60天后切片主動(dòng)脈驗(yàn)證了大鼠粥樣硬化動(dòng)物模型成功，且檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)發(fā)現(xiàn)AS組比CON組GSH-Px、SOD、CAT表達(dá)含量均明顯下降，MDA 含量升高，說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)大鼠抗氧化能力下降，雙重證實(shí)該動(dòng)物模型復(fù)制成功[4]。銀杏總黃酮最重要的活性成分為總黃酮和萜內(nèi)酯，有顯著的擴(kuò)張血管、抗氧化能力，能延緩衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)、清除體內(nèi)自由基[1-4]。程嘉藝[1]等研究證實(shí)銀杏總黃酮降低Caspase-3表達(dá)從而對(duì)抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。苑博等[9]研究發(fā)現(xiàn)銀杏總黃酮抑制NF-kapaB通路進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏總黃酮可以明顯降低LC3和beclin-1表達(dá)，抑制自噬的過(guò)度表達(dá)從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

自噬是一種在細(xì)胞溶酶體中發(fā)生的消化蛋白質(zhì)和細(xì)胞器活性的相對(duì)一個(gè)保守的機(jī)制，正常水平的自噬可自動(dòng)修復(fù)機(jī)體損傷，過(guò)度的自噬過(guò)程會(huì)加速組織細(xì)胞凋亡[7][11]。既往研究驗(yàn)證，自噬與心血管疾病有關(guān)。在急性缺血再灌注、擴(kuò)張性心肌病、高血壓心臟病以及衰老心肌中均發(fā)現(xiàn)了自噬的存在，自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[11]。巨噬細(xì)胞的自噬減少了泡沫細(xì)胞的積聚，抑制了斑塊形成。巨噬細(xì)胞的自噬減少斑塊中炎癥，穩(wěn)定斑塊，平滑肌細(xì)胞的自噬會(huì)加速纖維帽向變薄的方向發(fā)展，使斑塊不穩(wěn)定[5-6][10-12]。Martinet等[7]認(rèn)為，氧自由基引起beclin-1的高表達(dá)后，抗氧化可顯著降低beclin-1，這說(shuō)明，活性氧是通過(guò)調(diào)節(jié)beclin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞自噬[12]。Verheye等[5-7]發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均存在自噬現(xiàn)象。

Beclin-1是公認(rèn)的的在動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)的自噬基因，在溶酶體自噬降解途徑中起腫瘤抑制作用，對(duì)自噬體形成很重要[7-8]；LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母自噬相關(guān)基因8的同源物，LC3 的表達(dá)與自噬泡的多少成正相關(guān)，因此，LC3 被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子，作為檢測(cè)機(jī)體自噬程度，研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，導(dǎo)致LC3和Beclin-1表達(dá)增加，在大劑量膽固醇存在下，LC3蛋白含量升高，自噬泡聚集，自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤明顯抑制由膽固醇負(fù)荷誘導(dǎo)的自噬發(fā)生[13-14]。既往證實(shí)白藜蘆醇通過(guò)p38通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生進(jìn)而保護(hù)粥樣硬化[11]，本研究以白藜蘆醇為陽(yáng)性藥物對(duì)照，結(jié)果表明銀杏總黃酮均能上調(diào)自噬相關(guān)基因beclin-1蛋白和 LC3蛋白表達(dá)，產(chǎn)生抗氧化作用，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞粥樣斑塊或細(xì)胞浸潤(rùn)，阻止氧化應(yīng)激預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用將有可能為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的治療靶點(diǎn)，但銀杏總黃酮如何通過(guò)自噬抑制機(jī)體氧化的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。