混合型飼料添加劑中綠原酸檢測方法的建立及應用

李志娟，付 坤，丁 涵

（1.河南國康檢測技術有限公司，河南 鄭州 450003；2.河南中德檢測技術有限公司；3.河南省家禽業協會）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 混合型飼料添加劑：杜仲葉提取物原料，購自無錫正大生物股份有限公司。

1.1.2 綠原酸標準品：純度大于98.0%，FirstStandard公司。

1.1.3 磷酸：分析純，購自天津市福晨化學試劑廠。

1.1.4 甲醇、乙腈：色譜純，sigma。

1.2 主要儀器與設備

1.2.1 高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國Waters公司Waters2695；紫外檢測器2487。

1.2.2 反向色譜柱：美國WatersC18柱（250mm×4.6mm）。

1.2.3 分析天平：BT125D，感量0.00001g，賽多利斯。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液的制備

沙朗舞的腳下動作可分為四組：（一）單步的順邊移動；（二）雙腳自然邁步旁移，而且在單腳跳步的同時小腿帶動腳腕兒發力；（三）右腳為主動腳，右腳跳出，左腳跟上，身體重心伴隨腳步的變換而轉移；（四）腳腕兒主動發力突出往回勾腳，左、右側點地，同時快速轉換身體重心。四組不同的腳下動作共同構筑成一套完整的舞蹈短句，并以此短句為舞動單位，進而循環往復。舞段結束時，大家會在領舞的帶動下放開雙臂，交換舞步，形成新的舞蹈段落。每次跳沙朗舞大家都至少要跳出十幾個不同的舞段，舞段變換越豐富，大家的積極性就會愈發高漲。

精密稱取綠原酸對照品10mg（精確至0.0001g），置于10mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得。-20℃冰箱中保存，有效期6個月。

1.3.2 試樣的制備與保存

稱取本品適量（約相當于綠原酸10mg，精確至0.0001 g），置于100mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容至刻度，充分搖勻，過濾，棄去初濾液，取續濾液作為試樣溶液。

1.3.3 質量控制樣品的制備

1.3.3.1 空白樣品 取空白試樣，與待測試樣同步處理。

1.3.3.2 添加樣品 取空白試樣1.0g（精確至0.0001g），添加1000μg/mL的標準中間工作液1.0mL，制得濃度為1000mg/kg的陽性添加試樣，與待測試樣同步處理。

1.4 儀器參數與測定

色譜條件優化：色譜柱：美國WatersC18柱（25cm×4.6 mm）；柱溫：40℃，流動相：乙腈：0.4%磷酸溶液=13:87；流速1.0mL/min，進樣量：20μL。紫外檢測器，波長327nm。

1.5 線性關系分析

準確量取綠原酸標準溶液，用甲醇稀釋成濃度分別為4.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00μg/mL的系列標準工作液，在上述色譜條件下進行測定，繪制標準曲線，以濃度為橫坐標，以樣品的峰面積為縱坐標，計算回歸方程、分析線性范圍。

1.6 精密度試驗

取適量綠原酸對照品溶液，在上述色譜條件下連續進樣6次（進樣量為20μL），檢測其峰面積和保留時間，計算RSD值。

1.7 重復性試驗

取同批次的樣品杜仲葉提取物，制備6份樣品溶液，按上述過程進樣20μL進行檢測，計算綠原酸的RSD值。

1.8 樣品檢測

隨機抽檢市場委托的混合型飼料添加劑杜仲葉提取物5份，采用該文建立的方法測定其中綠原酸的含量。

2 結果與分析

2.1 線性關系、檢出限結果

該研究采用甲醇配置質量濃度5～40μg/mL的綠原酸標準溶液，按所建立的液相色譜條件進行測定，線性關系良好，線性方程y=60518.31x-12230.03（R2=0.999859），采用標準添加法，方法檢出限1mg/kg。

2.2 添加回收率試驗結果

5個樣品中，綠原酸的平均回收率80.2%～96.7%，說明方法所得結果的回收率滿足實驗要求，符合定量分析，其回收率和精密度結果詳見表1。

表1 綠原酸的加標回收率

2.3 精密度試驗結果

精密度試驗結果峰面積RSD值為0.104%，保留時間RSD值為0.011%，表明該方法精密度良好。結果見圖1。

圖1 綠原酸精密度試驗結果

2.4 重復性試驗結果

重復性試驗結果RSD值為0.22%，表明該方法重復性良好。結果見圖2。

圖2 綠原酸重復性實驗結果

2.5 方法應用結果

對市場委托的5份混合型飼料添加劑杜仲葉提取物，采用該文建立的方法測定其中綠原酸的含量，質控加標回收率均在80.2%～96.7%，說明本方法回收率良好，檢測結果準確。

3 討論與結論

該研究建立了一種專門用于混合型飼料添加劑—杜仲葉提取物中綠原酸含量的高效液相色譜檢測方法，通過摸索樣品前處理的方法和液相色譜的檢測條件，建立了快速簡便檢測混合型飼料添加劑中綠原酸含量的液相色譜方法。結果表明，樣品前處理方法只需甲醇溶液溶解定容即可；上機條件為：采用WatersC18（250mm×4.6mm）色譜柱，流動相乙腈：0.4%磷酸溶液=13:87洗脫，流速1.0mL/min，進樣量20μL，波長327nm，可以獲得良好的峰面積，該方法檢測限為1mg/kg；通過標準曲線的建立，表明該研究所建立的方法線性關系良好，線性方程y=60518.31x-12230.03（R2=0.999859）；該方法在2～10mg/kg添加濃度的平均回收率為81.2%～99.7%，精密度RSD≤3.6%。通過在5份混合型飼料添加劑的檢測應用，表明該方法能夠達到準確、快速、簡便、回收率高的特點，適用于混合型飼料添加劑中綠原酸的檢測。該研究的精密度試驗、重復性試驗、線性關系均良好，回收率可以達到相關研究的規定水平，該方法可以準確客觀地檢測出產品中的綠原酸有效成分，這為提高混合型飼料添加劑中綠原酸有效成分的檢測技術水平具有重要的意義，也為飼料安全監管部門提供了一個快速且準確的定量檢測方法。□