LINC01176對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其與上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

黃云，傅文凡，戴璐，江澤勇，吳文杰，趙健

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣州510095

肺癌是常見的惡性腫瘤，分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）兩種主要的組織學(xué)亞型，其中NSCLC是最主要的發(fā)病類型［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60% 以上的NSCLC 患者在初次就診時(shí)就發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤轉(zhuǎn)移而失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而50% 以上接受手術(shù)治療的NSCLC患者會(huì)再次復(fù)發(fā)并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［2］。因此，探索NSCLC 轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)改善NSCLC 患者生存率具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200 nt 的不編碼蛋白質(zhì)RNA 分子，主要通過(guò)與蛋白質(zhì)、miRNA 和mRNA 等大分子相互作用來(lái)參與表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等分子調(diào)控過(guò)程，從而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移［3］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 的異常表達(dá)與惡性腫瘤密切相關(guān)［4］。我們前期通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC01176在NSCLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但其在NSCLC 中的作用機(jī)制尚不明確。上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，其主要的特征有細(xì)胞黏附分子（如E-cadherin）表達(dá)減少、細(xì)胞骨架由角蛋白為主轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）為主等［5］。NSCLC 是上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，NSCLC 上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)化改變是轉(zhuǎn)移過(guò)程中至關(guān)重要的一個(gè)步驟［6］。2020年10 月—2021年5 月，本研究觀察了LINC01176在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并探討其是否通過(guò)調(diào)控EMT參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人正常肺上皮細(xì)胞株16HBE，人NSCLC 細(xì)胞株A549、H1299、H1975和H1650均購(gòu)自武漢普諾賽公司；LINC01176 siRNA 和LINC01176 siRNA 對(duì)照無(wú)干擾序列由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成。1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本ToYoBo公司，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，Tranwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。上皮標(biāo)志物Ecadherin、間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin 一抗及二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司，GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。

1.2 正常肺上皮細(xì)胞、NSCLC 細(xì)胞培養(yǎng)及LINC01176 表達(dá)檢測(cè) 用含10% 胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)正常肺上皮細(xì)胞16HBE，NSCLC 細(xì)胞A549、H1299、H1975 和H1650，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融和度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25% 的Trypsin-EDTA 溶液消化傳代。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LINC01176表達(dá)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE、A549、H1299、H1975 和H1650細(xì)胞，使用TRIzol 試劑分別提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：LINC01176 上游引物為5′-TGGATGGTTTAGCATTATCCC-3＇，下游引物為5′-CTCCAGCCAATACTTTAAACAG-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計(jì)算LINC01176 相對(duì)表達(dá)量。取LINC01176 相對(duì)表達(dá)量最高的NSCLC 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 NSCLC 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d 用6孔板鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×105～4×105，待細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染敲低組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組，分別按照LipofectamineTM3000試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)染LINC01176 siRNA 和LINC01176 siRNA對(duì)照無(wú)干擾序列48 h。

1.4 NSCLC 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，用無(wú)血清1640 培養(yǎng)基制作細(xì)胞懸液，離心重懸后調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，以5×104/孔接種于上室，取500 μL 含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基置于下室。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，PBS 清洗1 遍，甲 醇固定20 min，1% 結(jié)晶 紫染色15 min，用棉簽輕柔擦去上室未遷移細(xì)胞后用水清洗并晾干。小室干后將小室置于倒置顯微鏡下直接計(jì)算下室穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照，穿膜細(xì)胞數(shù)越多表示細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。

1.5 NSCLC 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。使用馬克筆在6 孔板背后沿直尺均勻劃5 條橫線，間隔為0.5～1.0 cm，橫穿過(guò)孔。取兩組細(xì)胞常規(guī)消化，以5×105/孔接種至6 孔板過(guò)夜培養(yǎng)，使用小槍頭沿直尺盡量垂直于背后的橫線在6 孔板中間劃痕。PBS 洗滌3 次，洗去劃下的細(xì)胞。加入無(wú)血清培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)并拍照（0 h），12 h后在相同位置拍照，使用熒光倒置顯微鏡標(biāo)尺計(jì)算0 h～12 h的細(xì)胞遷移距離。

1.6 NSCLC細(xì)胞EMT情況觀察

1.6.1 E-cadherin、Vimentin mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，操作方法同“1.3”。引物序列：E-cadherin 上游引物5′-GGGGTCTGTCATGGAAGGTG-3′，下游引物5′-CGACGTTAGCCTCGTTCTCA-3′；Vimentin 上 游引物5′-GCACATTCGAGCAAAGACAGG-3′，下游引物5′-TGAGGGCTCCTAGCGGTTTA-3′。以GAPDH為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計(jì)算E-cadherin、Vimentin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6.2 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western Blotting 法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，加入適量RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF；冰浴裂解細(xì)胞15 min，用細(xì)胞刮刮取裂解物并將其吸入1.5 mL 的EP 管中；超聲裂解8 次后4 ℃12 000 g 離心15 min，吸取上清液至另一1.5 mL的EP管。BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min 后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳后將蛋白濕轉(zhuǎn)于PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，剪下所需的目的條帶；加入E-cadherin、Vimentin 一抗，4 ℃平衡搖床輕搖孵育過(guò)夜。PBST搖床漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)二抗搖床孵育，PBST 搖床漂洗3 次，每次10 min；用ECL發(fā)光液發(fā)光顯影，測(cè)定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值表示E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以± s 表示，組間比較行t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01176 在正常肺上皮細(xì)胞及NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)比較 LINC01176 在正常肺上皮細(xì)胞16HBE 及NSCLC 細(xì)胞A549、H1299、H1975 和H1650 中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.01、6.82 ±0.33、13.19 ± 1.50、99.35 ± 0.81、6.89 ± 1.73，LINC01176在NSCLC細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量均高于正常肺上皮細(xì)胞（P均<0.05），其中H1975 細(xì)胞的LINC01176表達(dá)量最高。

2.2 LINC01176 對(duì)H1975 細(xì)胞侵襲的影響 轉(zhuǎn)染敲低組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（847.33 ±50.06）、（1 715.67 ± 55.47）個(gè)，轉(zhuǎn)染敲低組穿膜細(xì)胞數(shù)少于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 LINC01176對(duì)H1975細(xì)胞遷移的影響 轉(zhuǎn)染敲低組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞遷移距離分別為（489.37 ±16.14）、（556.07 ± 12.41）μm，轉(zhuǎn)染敲低組細(xì)胞遷移距離小于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.05）。見圖1。

圖1 LINC01176對(duì)H1975細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）

2.4 LINC01176對(duì)H1975細(xì)胞E-cadherin、Vimentin表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染敲低組E-cadherin mRNA 及蛋白表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組，Vimentin mRNA 及蛋白表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P均<0.05）。見表1。

表1 LINC01176對(duì)H1975細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響（ ± s）

表1 LINC01176對(duì)H1975細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響（ ± s）

注：與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別轉(zhuǎn)染對(duì)照組轉(zhuǎn)染敲低組E-cadherin mRNA 1.00 ± 0.09 2.58 ± 0.20*蛋白1.00 ± 0.13 3.36 ± 0.08*Vimentin mRNA 1.00 ± 0.15 0.51 ± 0.03*蛋白1.00 ± 0.10 0.58 ± 0.05*

3 討論

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤致命的主要原因，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［7］。研究顯示，lncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（MALAT1）可作為調(diào)控miR124/STAT3 和miR206/AKT 信號(hào)通路的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，其還可通過(guò)與人體抑癌基因p53啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)抑制p53活性，調(diào)控影響肺腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展的下游基因，促進(jìn)肺腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［8］。lncRNA HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HO?TAIR）被發(fā)現(xiàn)在肺腫瘤組織中高表達(dá)，可促進(jìn)肺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［9］。lncRNA 肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（LCAT1）可通過(guò)吸附miR-4715-5p 作為ceRNA發(fā)揮促癌作用，其在肺腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且其上調(diào)程度與肺癌患者的預(yù)后成反比［10］。本研究通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，LINC01176 在NSCLC 中表達(dá)上調(diào)，這與我們的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果相一致。進(jìn)一步分析LINC01176 對(duì)NSCLC 細(xì)胞侵襲及遷移的影響，發(fā)現(xiàn)LINC01176 能夠抑制NSCLC 細(xì)胞的侵襲和遷移，即LINC01176 參與了NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控過(guò)程。目前，尚未有關(guān)于LINC01176 的文獻(xiàn)研究報(bào)道，其在細(xì)胞中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的多步驟過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)分離、突破相關(guān)屏障進(jìn)入血液、在血液中存活、突破相關(guān)屏障定植于遠(yuǎn)處組織、在轉(zhuǎn)移部位生長(zhǎng)等［11］。在NSCLC 中，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與EMT 密切相關(guān)［12］。在胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、組織重建等正常生理過(guò)程中，通過(guò)EMT 的作用，黏附細(xì)胞之間的連接開始消失，細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)能力，然后遷移到新的部位發(fā)揮生物學(xué)功能［13］。在腫瘤組織中，為了侵襲臨近組織、擴(kuò)散到遠(yuǎn)處組織并形成轉(zhuǎn)移灶，腫瘤上皮細(xì)胞必須轉(zhuǎn)變成間質(zhì)表型。EMT 在這一轉(zhuǎn)變過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，使得腫瘤上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性、與基底膜的連接等上皮表型，同時(shí)獲得了抗凋亡、可降解細(xì)胞外基質(zhì)等間質(zhì)表型，從而導(dǎo)致細(xì)胞具有較高的遷移性和侵襲性［14］。在細(xì)胞發(fā)生EMT 的生物學(xué)過(guò)程中，細(xì)胞黏附分子（如E-cadherin）表達(dá)減少，細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin 為主的細(xì)胞骨架［15］。E-cadherin 是跨膜糖蛋白，參與維持上皮細(xì)胞間的連接和組織［16］。Vimentin 是中間絲蛋白，在細(xì)胞遷移、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用［17］。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染敲低LINC01176 可抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 的表達(dá)、促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)。這提示轉(zhuǎn)染敲低LINC01176 可抑制EMT過(guò)程、降低腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，LINC01176可通過(guò)調(diào)控EMT過(guò)程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述，LINC01176在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的侵襲和遷移，其作用可能是通過(guò)參與調(diào)控EMT 實(shí)現(xiàn)的。在未來(lái)的研究中，我們將進(jìn)一步探究LINC01176 調(diào)控EMT 的具體分子機(jī)制，以及LINC01176在NSCLC轉(zhuǎn)移中的臨床應(yīng)用。