CXCL12/CXCR4通路在人肺腺癌細胞誘導破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化中的作用

陳聰，趙雪強，林云，蔣碧佳，李寧，銀建華，盧春蘭，周成風，曾錦榮

桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西桂林541199

肺癌是引起人類死亡最常見的惡性腫瘤之一。隨著手術、放化療、靶向治療及免疫治療等綜合治療的開展，肺癌患者的中位生存期較前明顯延長，但骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率亦隨之增高。這導致肺癌患者治療負擔日益加重，必須采用積極有效的防治措施。趨化因子受體4（CXCR4）于2001年被發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織中表達升高，并與疾病的不良預后有關［1］。趨化因子12（CXCL12）是CXCR4 的惟一配體，其水平反映CXCR4 活性。CXCL12/CXCR4 通路與白細胞運輸、癌性骨痛和術后疼痛等一系列生理、生化及病理過程有關，也是腫瘤細胞與體內(nèi)微環(huán)境溝通的重要物質(zhì)［2］。白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）是常見的炎癥細胞因子，其在腫瘤骨侵襲破壞的微環(huán)境中起促進作用。2019年10 月—2021年2 月，我們觀察了CXCR4 競爭性拮抗劑AMD3100干預肺腺癌A549 細胞與破骨細胞前體細胞共培養(yǎng)后破骨細胞的分化情況，初步探討通過抑制CX?CL12/CXCR4是否能影響破骨細胞的分化及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺腺癌細胞株A549、破骨細胞前體細胞（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7）均購于中科院昆明細胞庫；AMD3100購自上海陶素生化科技有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)液購自美國賽默飛世爾科技公司；Transwell 小室購自美國康寧公司；抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；TRNzol Universal 總RNA 提取試劑、第一鏈cDNA 合成試劑盒及破骨細胞標志物組織蛋白酶K（CTSK）、降鈣素受體（CTR）、TRAP、破骨細胞分化因子受體（RANK）熒光定量試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；CXCL12、IL-6、TNF-α 檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RAW264.7、A549細胞培養(yǎng) 將RAW264.7、A549 細胞分別接種于含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，待細胞生長至對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RAW264.7 細胞分組與干預處理 取對數(shù)生長期的A549 和RAW264.7 細胞，PBS 洗滌2 遍后胰酶消化A549 細胞，吹落RAW264.7 細胞；以800 r/min 離心5 min，加入配制好的DMEM 培養(yǎng)基分別制備成1×104/mL 的A549 單細胞懸液及2×103/mL 的RAW264.7 單細胞懸液，并將RAW264.7細胞隨機分為干預組和對照組。兩組均在6 孔的Transwell 下室接種RAW264.7 細胞，上室接種A549細胞，并保證上室的細胞培養(yǎng)在下室培養(yǎng)基中；干預組在小室內(nèi)分別加入含12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL AMD3100的培養(yǎng)基，對照組僅加入培養(yǎng)基；兩組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每2～3 d 換液1 次。

1.2.3 RAW264.7 細胞向破骨細胞分化情況觀察 采用TRAP 染色法。取用兩組培養(yǎng)7 d 的Tran?swell 小室，去除Transwell 上室，棄除下室內(nèi)剩余培養(yǎng)基；用PBS 洗滌2 遍，用TRAP 固定液4 ℃避光固定60 s；水洗，稍微晾干。加入TRAP孵育液工作液，37 ℃避光浸染1 h 后水洗；用蘇木紫染色液復染4 min后水洗晾干，鏡檢。在高倍光學顯微鏡下隨機取5 個視野并進行計數(shù)，細胞核數(shù)目≥3 個且TRAP染色陽性視為破骨細胞。

1.2.4 破骨細胞標志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表達檢測 采用qPCR 法。取兩組培養(yǎng)7 d 的Transwell 小室，去除Transwell 上室，棄除下室內(nèi)剩余培養(yǎng)基；用PBS 洗滌2 遍，用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA；按提供的試劑操作步驟進行操作，用第一鏈cDNA 合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列：CTSK 上游為5′-TATGACCACT?GCCTTCCAATAC-3′，下游為5′-GCCGTGGGGT?TATACATACA-3′；CTR上游為5′-CTGATTGTCATG?GCTGTGTTTAC-3′，下游為5′-GCCGTGGGGTTATA?CATACA-3′，TRAP 上游為5′-GTCAAGAACTTGC?GACCATTG-3′，下游為5′-CGTTCTCGTCCTGAA?GATACTG-3′；RANK 上游為5′-GAAGATTCCCA?CAGAGGATGAG-3′，下游為5′-TTGCTTCCCTGCT?GGATTAG-3′；內(nèi)參GAPDH 上游為5′- GGAGA?AACCTGCCAAGTATGA -3′，下游為5′- TCCTCAGT?GTAGCCCAAGA -3′。qPCR 反應體系10 μL；反應條件：95 ℃預變性15 min 后，95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸25 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.5 小室上清液中細胞因子CXCL12、IL-6、TNF-α 水平檢測 采集Transwell 小室上清液，采用ELISA 法檢測CXCL12、IL-6、TNF-α，按試劑盒操作步驟進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s 表示，多組間比較行多因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組RAW264.7 細胞分化為破骨細胞的數(shù)量比較 干預組在12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL AMD3100 處理后，RAW264.7 細胞向破骨細胞分化數(shù)量分別為（81 ± 3）、（49 ± 3）、（34 ± 3）、（11 ± 2）個，均低于對照組的（99 ± 5）個（P均<0.05）；且隨著AMD3100 處理濃度的增加，RAW264.7 細胞向破骨細胞分化數(shù)量逐漸減少（P均<0.05）。

2.2 兩組破骨細胞標志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表達比較 與對照組比較，干預組在不同濃度AMD3100 干預后破骨細胞標志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表達減少（P均<0.05）；且隨著AMD3100處理濃度的增加，破骨細胞各標志物表達逐漸減少（P均<0.05）。見表1。

表1 兩組破骨細胞標志物TRAP、CTSK、CTR、RANK mRNA表達比較（±s）

表1 兩組破骨細胞標志物TRAP、CTSK、CTR、RANK mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與干預組上一濃度比較，#P<0.05。

組別干預組12.5 μg/mL AMD3100 25.0 μg/mL AMD3100 50.0 μg/mL AMD3100 100.0 μg/mL AMD3100對照組TRAP mRNA 0.69 ± 0.04*0.45 ± 0.03*#0.28 ± 0.02*#0.21 ± 0.02*#1.00 ± 0.02 CTSK mRNA 0.72 ± 0.08*0.37 ± 0.03*#0.32 ± 0.01*#0.14 ± 0.03*#1.00 ± 0.02 CTR mRNA 0.66 ± 0.04*0.50 ± 0.03*#0.38 ± 0.04*#0.23 ± 0.04*#1.00 ± 0.03 RANK mRNA 0.52 ± 0.04*0.33 ± 0.01*#0.19 ± 0.04*#0.12 ± 0.01*#1.00 ± 0.01

2.3 兩組小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平比較 與對照組比較，干預組在不同濃度AMD3100干預后小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平降低（P均<0.05）；且隨著AMD3100 處理濃度的增加，小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平逐漸降低（P均<0.05）。見表2。

表2 兩組小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α水平比較（±s）

表2 兩組小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與干預組上一濃度比較，#P<0.05。

組別干預組12.5 μg/mL AMD3100 25.0 μg/mL AMD3100 50.0 μg/mL AMD3100 100.0 μg/mL AMD3100對照組CXCL12（ng/mL）22.69 ± 3.43*16.80 ± 0.92*#13.02 ± 0.57*#4.33 ± 1.49*#36.27 ± 1.80 IL-6（pg/mL）42.17 ± 2.35*34.00 ± 3.25*#25.26 ± 2.60*#6.71 ± 1.61*#62.75 ± 2.52 TNF-α（pg/mL）65.46 ± 5.28*#46.83 ± 1.04*#33.51 ± 0.51*#16.79 ± 6.74*#94.59 ± 3.38

3 討論

肺癌是近年來引起人類死亡最常見的惡性腫瘤之一，經(jīng)過手術、放化療、靶向治療及免疫治療等綜合治療后，患者的中位生存期較前明顯延長［3］，但肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率亦隨之增高。肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時，腫瘤細胞首先與細胞外基質(zhì)分離，然后遷移、侵襲并滲入血液循環(huán)中，當其到達骨骼后繼續(xù)增殖并形成新的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。骨轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生，往往預后較差，是臨床上降低肺癌患者生活質(zhì)量和影響其生存的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞、破骨細胞、成骨細胞和骨基質(zhì)細胞相互作用，促進溶骨性骨轉(zhuǎn)移的形成和發(fā)展，抑制以上任何一個因素都有可能降低骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。

近年來，對于趨化因子及其受體與肺癌的研究逐漸成為熱點。目前，已經(jīng)明確CXCR4在多種腫瘤細胞中高表達，其在肺癌患者原發(fā)病灶組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及骨轉(zhuǎn)移灶的表達均有升高［4］，并與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移有關［5］。CXCL12是CXCR4的惟一配體，兩者構成CXCL12/CXCR4啟動下游信號通路以維持組織體內(nèi)的平衡，在參與免疫細胞的生存與轉(zhuǎn)運的同時也支持腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移［2］。 CXCR4 拮抗劑AMD3100 的作用基礎是競爭性抑制CXCL12 與CXCR4結(jié)合，抑制CXCL12/CXCR4造成的生物學效應。在該實驗中我們使用AMD3100干預肺癌骨轉(zhuǎn)移模型，通過TRAP染色確定使用AMD3100干預后肺癌骨轉(zhuǎn)移模型中破骨細胞數(shù)量減少；通過對共培養(yǎng)模型中細胞mRNA的測定，發(fā)現(xiàn)破骨細胞標記基因CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA表達減少；在共培養(yǎng)模型上清液中檢測到IL-6、TNF-α及CXCL12分泌下降。

破骨細胞是由骨髓中髓系祖細胞分化而成的單核巨噬細胞相互融合形成的多核巨細胞［6］，其分化的經(jīng)典信號通路包括巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）、NF-κB配體RANKL以及免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）共刺激信號通路［7］。破骨細胞分化的典型途徑需要存在RANKL 和M-CSF 的受體激活劑，但一部分細胞因子或生長因子可以替代RANKL或M-CSF 以誘導破骨細胞形成，如TNF-α、IL-6、IL-11 和IL-8 等；同時，這些生長因子也可以影響RANKL/M-CSF誘導的破骨細胞形成［8］。研究顯示，IL-6在肺癌細胞株高分泌，并能增加肺癌細胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移進而影響肺癌的轉(zhuǎn)移［9-10］；有回顧性研究表明，IL-6 的高分泌與骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展有顯著相關性［11］。TNF-α 是一種多功能細胞因子，其持續(xù)高分泌可以促進腫瘤的侵襲，而TNF-α 高分泌腫瘤患者通常具有較高的轉(zhuǎn)移率與復發(fā)率［12］。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞的形成離不開其細胞外基質(zhì)和營養(yǎng)。在肺癌骨轉(zhuǎn)移病灶中，一系列的細胞因子、趨化因子對骨轉(zhuǎn)移灶的形成與進展起重要作用，如CXCL12、IL-6、TNF-α、RANKL 等，這些因子可以促進破骨細胞的分化、增殖和活化［13］。在肺癌骨轉(zhuǎn)移病灶中，CXCL12、IL-6、TNF-α、RANKL 等一系列細胞因子、趨化因子對骨轉(zhuǎn)移灶的形成與進展起重要作用，并促進破骨細胞的分化、增殖和活化；不斷生成的腫瘤細胞會分泌更多的因子，促進破骨細胞的生成，導致發(fā)生進一步的溶骨，形成“惡性循環(huán)”，進而在骨組織局部形成腫瘤微轉(zhuǎn)移灶［14］。

綜上所述，AMD3100 通過影響CXCL12/CXCR4通路活性，減少細胞因子如IL-6、TNF-α 和CXCL12的分泌，抑制人肺腺癌細胞誘導破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化，并可能因此抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)生和發(fā)展。但是，通過影響CXCL12/CXCR4 是如何降低IL-6、TNF-α 和CXCL12 的分泌，以及過表達CXCR4 及沉默CXCR4 又會如何影響肺癌骨轉(zhuǎn)移中的細胞因子及基因，仍需要繼續(xù)探索。