結腸癌組織中miR-383、Notch1 mRNA表達變化與患者臨床病理參數及預后的關系

趙亮，張帥，王海龍

1 天津市中醫藥研究院附屬醫院普通外科，天津300120；2 天津市人民醫院胃腸外科；3 天津市中醫藥研究院附屬醫院腫瘤科

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，在我國已成為僅次于肺癌的第二大癌癥，嚴重威脅居民生命健康［1］。盡管目前對結腸癌分子機制的研究取得了一定進展，但針對結腸癌的標準藥物治療療效仍存在局限，尋找新的治療靶點對預防和治療結腸癌具有重要意義［2-3］。微小RNA（miRNA）是一種單鏈非編碼內源性RNA 分子，能調控靶基因表達，在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用［4］。有研究發現，miR-383 在胃癌、宮頸癌中表達下調，并與腫瘤細胞周期進展、增殖、遷移、侵襲能力有關［5-6］。Notch1 是一種配體激活的轉錄因子，可與同源配體相互作用而改變蛋白構象，激活下游特定靶基因表達，在細胞發育、分化、增殖、凋亡等過程中發揮調節作用［7］。研究顯示，miR-383 可以靶向Notch1 來抑制結腸癌細胞的增殖和遷移能力，但關于二者與患者臨床病理參數及預后的關系尚無研究報道［8］。基于此，本研究觀察了結腸癌患者腫瘤組織中miR-383、Notch1 mRNA 的表達變化，并探討其與患者臨床病理參數及預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經天津市中醫藥研究院附屬醫院倫理委員會批準，收集2015年1 月—2016年5 月在我院行手術治療結腸癌患者的臨床資料。納入標準：①經術后病理確診為結腸癌；②未接受任何抗腫瘤治療；③病理資料和隨訪資料完整；④患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：①合并其他部位腫瘤；②合并腸道感染性疾病或潰瘍性結腸炎；③合并心、肝、腎等重要臟器功能損害；④合并自身免疫性疾病。共篩選得到符合上述標準的結腸癌患者126例，其中男75 例、女51 例，年齡28～76（57.54 ±5.63）歲，腫瘤直徑≥5 cm 55 例、<5 cm 71 例，分化程度低分化25 例、低中分化41 例、高分化60 例，TNM分期Ⅰ期57例、Ⅱ期36例、Ⅲ期18例、Ⅳ期15例，18例伴淋巴結轉移、108例未有淋巴結轉移。

1.2 結腸癌及癌旁組織標本獲取 于術中切除結腸癌患者部分腫瘤組織以及距腫瘤組織>5 cm 的癌旁正常組織，立即液氮冷凍，于-80 ℃冰箱中保存組織待用。

1.3 結腸癌及癌旁組織miR-383、Notch1 mRNA 表達檢測 采用RT-qPCR 法。各組織取50 mg 研磨后，使用TRIzol試劑盒提取總RNA，Takara試劑盒轉錄合成cDNA，使用SYBR Green Master Mix 進行PCR 擴 增。 miR-383 上 游 引 物5′-GCACACATT?GAAGAGGACAGAAC-3′、下游引物5′-TATT?GAAGGGGGTTCTGGTG-3′，Notch1 上 游 引 物5′-GAGGCGTGGCAGACTATGC-3′、下游引物5′-CTT?GTACTCCGTCAGCGTGA-3′，miR-383 內參U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，Notch1 內參GAP?DH 上 游 引 物5′-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3′、下游引物5′-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3′。PCR 反應條件：95 ℃30 s、95 ℃15 s、62 ℃30 s、72 ℃20 s，共40 個循環。采用2－ΔΔCt法計算目標基因miR-383、Notch1 mRNA的相對表達量。

1.4 患者預后觀察 以患者出院日為起點，通過門診或電話隨訪5年，記錄患者生存情況，隨訪至2021年5 月截止。以miR-383、Notch1 mRNA 表達量中位數為界限，≥中位數為高表達者，<中位數為低表達者，繪制miR-383、Notch1 mRNA 高表達者與低表達者的Kaplan-Meier生存曲線。

1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計量資料以± s 表示，組間比較行t 檢驗；計數資料以例或率表示；采用Pearson相關性分析結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA表達量的關系；繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-Rank 檢驗比較miR-383、Notch1 mRNA 高表達者與低表達者的生存時間。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌及癌旁組織miR-383、Notch1 mRNA 相對表達量比較 結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA相對表達量分別為1.06 ± 0.10、1.98 ± 0.34，癌旁組織miR-383、Notch1 mRNA相對表達量分別為2.37 ±0.54、1.00 ± 0.08，結腸癌組織miR-383 相對表達量低于癌旁組織，Notch1 mRNA相對表達量高于癌旁組織（P均<0.01）。結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA相對表達量呈負相關關系（r=-0.665，P<0.01）。

2.2 不同臨床病理參數患者結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA表達比較 見表1。

表1 不同臨床病理參數患者結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA表達比較（± s）

表1 不同臨床病理參數患者結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA表達比較（± s）

臨床病理參數性別男 女年齡≥60歲<60歲腫瘤直徑≥5 cm<5 cm分化程度低分化中高分化TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結轉移無 有n 75 51 70 56 55 71 25 101 93 33 108 18 miR-383 1.07 ± 0.11 1.05 ± 0.09 1.06 ± 0.11 1.07 ± 0.09 1.05 ± 0.10 1.07 ± 0.10 1.04 ± 0.12 1.07 ± 0.10 1.08 ± 0.10 1.02 ± 0.10 1.07 ± 0.10 0.99 ± 0.10 t 0.73-0.68-0.82-1.13 2.50-3.12 P 0.46 0.49 0.40 0.25 0.01<0.01 Notch1 mRNA 2.03 ± 0.34 1.93 ± 0.34 2.01 ± 0.33 1.95 ± 0.36 2.02 ± 0.34 1.95 ± 0.35 2.09 ± 0.41 1.96 ± 0.32 1.94 ± 0.32 2.12 ± 0.38 1.94 ± 0.33 2.23 ± 0.30 t 1.58 0.98 1.12 1.63-2.58 3.43 P 0.11 0.97 0.26 0.10 0.01<0.01

2.3 結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA 高、低表達患者預后比較 miR-383 高表達59 例、低表達67 例，5年生存率分別為77.97%（46/59）、49.25%（33/67）；Notch1 mRNA 高表達62 例、低表達64例，5年生存率分別為45.16%（28/62）、79.69%（51/64）。miR-383 高表達者5年生存率高于低表達者，Notch1 mRNA 高表達者5年生存率低于低表 達 者（P均<0.05）。 結 腸 癌 組 織miR-383、Notch1 mRNA 高、低表達者Kaplan-Meier 生存曲線見圖1。

圖1 結腸癌組織miR-383、Notch1 mRNA高、低表達者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

結腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活和飲食方式的改變及人口老齡化加劇，近年來結腸癌發生率和病死率呈上升趨勢。結腸癌的治療目前以手術為主，同時配合化療、放療等手段。因結腸癌細胞增殖能力以及對生物、放射、化學治療的耐藥性較強，所以切除后復發轉移率高，超過30%的結腸癌患者在手術治療后會出現局部復發或遠處轉移，且轉移性患者5年生存率僅為10%，總體預后仍然較差［3］。

miRNA 是表觀遺傳學的重要一環，其是由約22個核苷酸組成的非編碼RNA，可在3′-非翻譯區與靶基因的mRNA結合，導致靶基因轉錄后沉默，從而調控靶基因的表達［9］。研究顯示，結腸癌發生發展過程中存在多種miRNA 的異常表達，對結腸癌細胞增殖、遷移、浸潤等生物學行為產生影響［10-11］。miR-219a-1 可靶向Memo1 抑制結腸癌細胞增殖和入侵［10］，miR-513b-5p 能夠靶向轉錄激活因子3 抑制結腸癌細胞增殖和遷移［11］。miR-383 定位于人染色體8p22，在胚胎肝細胞、血管內皮細胞、腫瘤組織中有顯著變化，與機體細胞增殖、分化、遷移等多種病理生理過程有關。多項研究表明，miR-383 與多種實體腫瘤有關［12-13］。CHENG 等［12］研究顯示，miR-383能夠靶向過氧化物還原酶-3 抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。陳石嬌等［13］研究顯示，miR-383 能下調mutS 同源物6 抑制小兒髓母細胞瘤的增殖和侵襲。本研究結果顯示，miR-383 在結腸癌組織中的表達低于癌旁組織，并且與TNM 分期、淋巴結轉移有關，提示miR-383 的低表達與結腸癌惡性進展有關。研究顯示，上調miR-383 的表達可以抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的能力，其機制可能與miR-383 靶向增殖誘導配體、調節腫瘤高表達細胞周期相關蛋白抗體有關［14］。進一步繪制Kaplan-Meier 生存曲線，我們發現miR-383 高表達者術后5年生存率明顯提升，說明miR-383 低表達與結腸癌患者預后不良有關，可作為判斷預后的分子標志物。

傳統觀點認為，腫瘤的發生是癌基因激活與抑癌基因失活導致。隨著分子研究的深入，新近觀點認為，腫瘤發生是信號轉導途徑異常，使細胞接受異常增殖信號導致。Notch1 基因定位于人染色體9q34.3，作為一種配體激活的轉錄因子，Notch1能將胞外信號轉化為核內基因表達，具備細胞表面受體和核轉錄調控的雙重功能［15］。Notch1信號通路是一種高度保守的細胞間信號傳導途徑，參與調節個體發育和細胞增殖、分化、凋亡及血管新生等生物學功能，可通過激活磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白、核因子-κB 等多條信號通路促進惡性腫瘤發生［16］。本研究結果顯示，Notch1 在結腸癌組織中表達高于癌旁組織，且與TNM 分期、淋巴結轉移有關，提示Notch1 高表達參與結腸癌惡性進展，其機制可能與Notch1 可激活多條腫瘤相關信號通路有關。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，Notch1 高表達者術后5年生存率明顯降低，說明Notch1 高表達與結腸癌患者預后不良有關，可作為判斷預后的分子標志物。本研究結果還顯示，結腸癌組織中miR-383 與Notch1 mRNA 表達呈負相關，說明二者共同參與結腸癌發生發展，這與Notch1 為miR-383 下游調控靶點有關。miR-383 可靶向結合Notch1 的3′-非翻譯區，在結腸癌中，miR-383 高表達能抑制Notch1 表達，進而抑制結腸癌細胞增殖和遷移等能力，從而對患者預后產生影響［8］。

綜上所述，miR-383 在結腸癌組織中低表達、Notch1 mRNA 在結腸癌組織中高表達，且兩者的表達與TNM 分期、淋巴結轉移及預后相關。miR-383、Notch1 mRNA可能成為新的結腸癌診斷和預后判斷的分子標志物。但本研究樣本量較少，兩者之間的作用機制還需多中心大樣本研究證實。