耐碳青霉烯高毒力肺炎克雷伯菌的耐藥性及臨床、分子特征分析

黃韻，李從榮，汪倩鈺，唐克文

武漢大學人民醫院檢驗科，武漢430060

1986年，我國首次報道了社區無肝膽疾病患者感染高毒力肺炎克雷伯菌（HvKP）導致原發性化膿性肝膿腫并發生遠處轉移的特殊病例。與普通肺炎克雷伯菌（cKP）常造成免疫力低下人群的院內感染不同，HvKP 主要感染社區的健康個體，且具有病情進展迅速、感染灶多發、預后差等特點，對臨床診斷和治療提出更高要求。一般來講，HvKP 耐藥性較低，而cKP 在臨床藥物長期選擇性壓力的作用下表現出高耐藥性。近年來，關于HvKP 和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）的融合株—耐碳青霉烯高毒力肺炎克雷伯菌（CR-HvKP）的相關報道越來越多。2020年，一份關于CR-HvKP 的回顧性研究中發現，我國許多地方均有CR-HvKP 檢出，其中以河南省（25.4%）和山東省（25.8%）最為嚴峻［1］。毒力與耐藥融合形成的超級細菌勢必給臨床診療帶來極大挑戰，需引起臨床醫生的高度重視。正確監控和管理這種潛在威脅，迫切需要對CR-HvKPs 的流行病學特征和形成機制進行更深入的了解。因此，本研究分離了來自武漢大學人民醫院的CR-HvKP 菌株，分析其耐藥性及臨床、分子特征，以期更好地了解本地區CR-HvKP菌株的形成與發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株來源 收集2019年10 月—2020年10 月分離自武漢大學人民醫院臨床送檢標本的肺炎克雷伯菌，按照以下標準篩選：①通過Phoenix-100 全自動細菌鑒定藥敏系統檢測對碳青霉烯類（亞胺培南和/或美羅培南）耐藥；②通過PCR 檢測含有peg-344、iroB、iucA、rmpA 和rmpA2 毒力基因。剔除同一患者相同部位分離的重復菌株，共得到13株對碳青霉烯耐藥和含有上述毒力基因的肺炎克雷伯菌作為本研究的被檢CR-HvKP菌株。

1.1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：羊血培養基和MH 瓊脂平板（廣州迪景微生物科技有限公司）、藥敏紙片（英國OXOID 公司）、PCR 引物（武漢金開瑞生物合成有限公司）、2×Taq PCR Master Mix（上海萊

楓公司）、Gel-Red 核酸染料（北京Biotech 公司）、DL2000 DNA Marker（大連寶生物公司）、基質（德國Bruker Daltonik公司）、亞胺培南緩沖液（上海原科實業發展有限公司）。主要儀器：全自動細菌鑒定藥敏系統Phoenix-100（美國BD 公司）、MALDI-TOF 質譜儀［布魯克（北京）科技有限公司］、Vortex-5 渦旋振蕩器（鄭州南北集團）、Thermo Heraeus Multifuge X1R 高速離心機（美國Thermo 公司）、5430R 小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）、600A 型板式離心機（北京白洋公司）、NanoDrop 2000c 分光光度計（美國Thermo 公司）、T10TMPCR 儀（美國Bio-Rad公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）、G：BOX Chemi XT4全自動凝膠成像分析系統（英國SYN?GENE 公司）、PNOENIXSPEC 型比濁儀（美國BD 公司）和DKT200恒溫金屬浴（杭州米歐儀器有限公司）。

1.2 患者臨床資料收集 收集感染CR-HvKP 患者的臨床資料，包括發現科室、標本來源、感染部位、臨床結局等。

1.3 CR-HvKP 耐藥性觀察 采用Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏系統對CR-HvKP 菌株進行耐藥性檢測，采用Kirby-Bauer（K-B）法檢測頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥性。試驗操作及結果解釋參照CLSI M100（第30版）標準［2］。

1.4 CR-HvKP分子特征觀察

1.4.1 CR-HvKP 高黏液表型檢測 采用拉絲試驗確定CR-HvKP菌株是否為高黏液表型［3］。將菌株接種至5% 羊血培養基中，置于35 ℃，5% 的CO2培養箱中孵育18～24 h 后，用干燥的5 μL 接種環輕輕挑取菌落，若拉絲>5 mm 則判定為拉絲陽性，即為高黏液表型。

1.4.2 CR-HvKP 碳青霉烯酶表型檢測 采用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗［4］。將待測菌調制為0.5 麥氏濁度菌懸液后，均勻涂布于MH 瓊脂平板上，隨后將4張亞胺培南藥敏藥物紙片［不滴加溶液紙片、滴加10 μL 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液的紙片、滴加10 μL 3-氨基苯硼酸（APB）溶液的紙片、同時滴加10 μL APB 和EDTA 溶液的紙片］分別貼于瓊脂表面，孵育16～18 h 后量取紙片抑菌圈直徑。若滴加APB溶液的紙片與不滴加溶液的紙片抑菌圈直徑相差≥5 mm，則判斷該受試菌株產A 類碳青霉烯酶；若滴加EDTA 溶液的紙片與不滴加溶液的紙片抑菌圈直徑相差≥5 mm，即判斷該受試菌株產金屬β 內酰胺酶；若同時滴加APB 和EDTA 溶液的紙片與不滴加溶液的紙片抑菌圈直徑相差≥5 mm，則判斷該受試菌株同時產生A類碳青霉烯酶和金屬β內酰胺酶。

1.4.3 CR-HvKP 碳青霉烯酶耐藥基因、毒力相關基因及莢膜血清型檢測 采用PCR 法。煮沸法提取菌株DNA 模板，設計碳青霉烯酶耐藥基因blaK?PC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48，毒力基因peg-344、iroB、iucA、rmpA、rmpA2 及莢膜血清型K1、K2、K5、K20、K54、K47、K57、K64 引物。基因上、下游引物委托武漢金開瑞生物工程有限公司合成，詳見表1。PCR 反應體系共25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板3 μL 和ddH2O 8.5 μL，PCR 擴增反應條件參照既往文獻［5-6］。PCR 擴增產物經2.0% 瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統中觀察，以DL2000 DNA Marker作為分子量標準，出現明亮條帶且大小在預期范圍判斷為基因陽性［7］。PCR 產物經金開瑞公司完成測序，結果用BLAST 軟件與GenBank 上已公布的基因序列進行比對分析。

表1 基因擴增引物序列

1.4.4 CR-HvKP 多位點序列分型（MLST）檢測擴增CR-HvKP 的7 對管家基因（rpoB、gapA、mdh、Pgi、phoE、tonB、infB）并進行測序，得出每個菌株各個位點的等位基因數值，應用MLST 數據庫（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.ht?ml）對菌株的序列類型（ST）進行分型。

2 結果

2.1 CR-HvKP患者臨床特征 13例CR-HvKP感染患者中，男9 例、女4 例，年齡中位數為57（46～77）歲。13例CR-HvKP菌株有7株來自重癥醫學科、2株來自呼吸與危重癥醫學科、2 株來自胰腺外科，標本有8株來自痰標本、3株來自尿標本；感染患者合并多部位感染11例、單部位感染2例，臨床結局死亡5例、放棄治療4例、院外治療2例、好轉出院2例。

2.2 CR-HvKP 耐藥性檢測結果 所有CR-HvKP 菌株對臨床常用抗菌藥物阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、復方新諾明、環丙沙星、左氧氟沙星、亞胺培南和厄他培南耐藥；大部分菌株對妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、氯霉素和米諾環素耐藥；所有菌株對黏菌素、替加環素及新型藥物頭孢他啶/阿維巴坦敏感。

2.3 CR-HvKP 分子特征檢測結果 13株CR-HvKP菌株中有3 株為高黏液表型，高黏液表型陽性率為23.1%（3/13）。CR-HvKP 菌株均產A 類碳青霉烯酶（KPC 型），MLST 分型均為ST11 型，莢膜血清學分型均為K64 型。CR-HvKP 菌株均攜帶peg-344、iroB、iucA、rmpA 和rmpA2 5 種毒力基因的3 種及以上，其中以rmpA+rmpA2+iucA+peg-344共同攜帶為主。

3 討論

耐多藥細菌，特別是同時具有高毒力的細菌，是臨床醫療環境中的一個新興問題。迄今發現的大多數HvKp 菌株對大部分抗菌藥物敏感，但近期關于CR-HvKP 在我國的報道越來越多［8］。2016年，浙江大學附屬醫院綜合ICU 病房發生了由CR-HvKP 引起的呼吸機相關性肺炎暴發［3］。近期研究顯示，與普通CRKP 相比，CR-HvKP 在生長方面沒有發現差異，表明CR-HvKP 的適應性成本有限，但其高毒力的傳播可能極其迅速，這對公共衛生和感染控制提出了重大挑戰［1］。加強臨床對各種CR-HvKP感染的認識和其耐藥性監測是必要的，這需要對CR-HvKP感染的微生物和分子特征進行更深入的研究。

目前，臨床上對CR-HvKP 的研究較為匱乏且大部分信息較為零散。大部分研究僅通過高黏液表型檢測陽性來定義HvKP，然而并不是所有的HvKP 菌株都是高黏性的，且一些cKP 菌株也具有高黏液表型［5，9-10］。本研究中，13 株CR-HvKP 菌株中僅有3 株為高黏液表型，可以從側面顯示僅靠高黏液表型來判斷HvKP 不夠嚴謹。有研究發現，多種生物標志物peg-344、iroB、iucA、rmpA 及rmpA2 常出現在HvKP 毒力質粒，這些標志物對HvKP 具有較高的診斷準確性，使用這些生物標志物可為HvKP 感染提供更可靠的數據［5］。因此，本文以peg-344、iroB、iucA，rmpA，和rmpA2基因陽性來鑒定HvKP。

CR-HvKP 較cKP 毒力與侵襲力均有增強，本院發現的CR-HvKP 感染患者大部分發生了轉移擴散，造成兩部位及以上的共感染，其中以肺、血液、泌尿感染最為常見。13 株CR-HvKP 中有9 株來自于重癥醫學科，查閱患者病歷，發現其余4例患者也都曾轉入過重癥醫學科。我們分析：一方面，重癥醫學科患者大多患有多種嚴重基礎性疾病、抵抗力差、抗生素使用頻次高、需長期住院治療，這些均為感染CRKP 的獨立危險因素；另一方面，共用創傷性醫療器械，如呼吸機、導尿管、中央靜脈導管等，存在較高的院內感染的風險。這就警醒臨床上需要加強對CR-HvKP 檢出科室的院內感染防控，科學合理用藥，減少CR-HvKP在患者之間的傳播。13例患者中有5 例因合并嚴重感染而死亡，另有4 例放棄治療，可見CR-HvKP 感染對患者的臨床結局有著很嚴重的負面影響。值得注意的是，在關于HvKP 較早的報道中，感染的主要為社區健康人群，而本研究中的13 例患者均為院內免疫力低下人群，這種流行病學的轉變與北京的兩家醫院相似［11］。這提示HvKP 不僅會在社區環境中引起感染，也會在醫療環境中引起感染。對在本院發現的CR-HvKP 菌株進行耐藥性檢測，發現CR-HvKP 菌株對臨床大多數藥物耐藥，僅對替加環素、黏菌素及新型藥物頭孢他啶/阿維巴坦保持較高的敏感性，可見供臨床使用的有效藥物極其有限，而感染CR-HvKP 菌株的患者通常患有嚴重的基礎疾病，持續的感染會使基礎疾病變得更持久、更嚴重，這對患者來說有可能是致命的，必須引起臨床足夠的重視。

A 類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被APB 抑制、金屬β 內酰胺酶的活性可被EDTA 抑制，因此，APB聯合EDTA可對單產A類絲氨酸碳青霉烯酶、單產B類金屬β 內酰胺酶以及同時產生A 類絲氨酸碳青霉烯酶和B 類金屬β 內酰胺酶的腸桿菌目細菌進行檢測并區分［12-14］。本研究的所有CR-HvKP 菌株均產A類碳青霉烯酶，均為攜帶KPC 的ST11 型，為我國CRKP 流行的主要分型。所有CR-HvKP菌株莢膜血清型均為K64 型，這與YANG 等［6］關于中國CRHvKP 的多中心研究結果一致。 而通常報道的HvKP 為一般為ST23 型，且毒力相關莢膜血清型以K1、K2 為主。由此推測，本院的CR-HvKP 可能主要為同一型別CRKP 獲取了部分毒力質粒而形成。毒力基因方面，本院CR-HvKP 以rmpA+rmpA2+iucA+peg-344 共同攜帶為主，雖缺失iroB，但有小鼠感染模型表明iroB 編碼的沙門菌素丟失對毒力的影響較小［15］。

綜上所述，本院共發現CR-HvKP 菌株13 株，主要集中于重癥醫學科，患者通常有多部位的共感染，臨床結局較差。CR-HvKP 菌株對大部分臨床常用抗菌藥物耐藥，僅對黏菌素、替加環素及新型藥物頭孢他啶/阿維巴坦敏感。13 株CR-HvKP 菌株中有3例為高黏液表型，均產A類碳青霉烯酶，主要毒力基因組合為rmpA+rmpA2+iucA+peg-344，莢膜血清學分型均為K64 型，MLST 分型均為ST11 型，提示所有檢出的CR-HvKP可能為同一型別CRKP獲取了部分毒力質粒形成的。CR-HvKP 因其高耐藥性和高毒力的結合，可引起較為復雜和嚴重的感染，醫院相關部門應加強相應感染控制措施的監督和實施，包括抗菌藥物的合理使用及流行病學監測等，防止CRHvKP菌株感染的暴發流行。