藍(lán)莓花色苷的酶法酰化修飾及其疏水性改善研究

洪森輝，楊秀雯，黃曉雪，費(fèi) 鵬,

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建漳州 363000；2.閩南師范大學(xué)閩臺(tái)特色園林植物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建漳州 363000）

花青素是以2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子為母核的黃酮類物質(zhì)，一種水溶性色素[1?2]，現(xiàn)已知的花青素有20 多種，主要存在于植物中[3?5]。然而自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見(jiàn)，花青素通常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖在C3、C5、C7、C3'、C5'位以糖苷鍵相連形成花色苷，其中，C3 位是最常見(jiàn)的結(jié)合點(diǎn)[6?8]。迄今為止，人們已從自然界分離鑒定出600 多種花色苷[9?11]。花色苷除了作為多酚類色素應(yīng)用于食品之外[12?13]，還具有廣泛的藥理作用，如促進(jìn)類維生素A 再生、抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等生理活性[14?16]。

花色苷作為一種天然抗氧化劑和多酚色素，已成為食品添加劑研究的熱點(diǎn)。作為一種抗氧化活性較好的天然色素[17?18]，花色苷經(jīng)常被用作葡萄酒、飲料、果醬、糕點(diǎn)和糖果的染色劑，以改善顏色、風(fēng)味、保質(zhì)期和健康特性[19?21]。但花色苷的脂溶性差，不利于在非水體系中發(fā)揮抗氧化作用，限制了其在某些高脂食品中的應(yīng)用，如冰激凌、肉制品、油炸制品和食用油等[22]。向花色苷分子上引入親脂性基團(tuán)是提高其疏水性的一個(gè)有效方案。在前期研究中，Cai 等[23]以肉桂酰氯為酰化劑，以4-二甲氨基吡啶為催化劑，通過(guò)固相反應(yīng)法對(duì)藍(lán)莓花色苷進(jìn)行了酰化修飾，結(jié)果表明花色苷的脂溶性顯著提高。但化學(xué)酰化法產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)難以厘清。Yang等[24]以異丙醇為溶劑，脂肪酶為催化劑，將月桂酸接枝于黑醋栗花色苷上以改善其疏水性。但花色苷在異丙醇中的溶解度很低，酰化花色苷的制備效率難以讓人滿意。

本文擬以脂肪酶為催化劑，阿魏酸和咖啡酸為基供體，在水/四氫呋喃兩相體系中對(duì)藍(lán)莓花色苷進(jìn)行酰化修飾以改善其疏水性，并進(jìn)一步探討了酚酸基團(tuán)的引入對(duì)花色苷抗氧化活性的影響。本文為藍(lán)莓花色苷作為著色劑和功能性食品添加劑在高脂類食品中的應(yīng)用提供了理論支撐與經(jīng)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓花色苷 西安圣青生物科技有限公司（370.2 mg/g，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)）；脂肪酶（≥5000 U/g，重組酶，在黑曲霉中表達(dá)）、溴化鉀上海阿拉丁試劑有限公司；阿魏酸、咖啡酸、亞油酸、β-胡蘿卜素 上海麥克林試劑有限公司；無(wú)水乙醇、吐溫80、四氫呋喃 西隴科學(xué)股份有限公司；本文所用試劑，除非另有說(shuō)明，否則均為分析純。

MultiSkan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾有限公司；LC-RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海力辰儀器科技有限公司；NICOLET IS 10 傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾有限公司；T9 紫外-可見(jiàn)分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酰化花色苷的制備 本文采用Novozym 435 脂肪酶催化法制備酰化藍(lán)莓花色苷[25]。具體步驟如下：將30 mmol 阿魏酸和4.5 g 天然藍(lán)莓花色苷（native anthocyanins,Na-An）分別溶解于100 mL 四氫呋喃和100 mL 去離子水中，然后將兩者混合并加入1 g Novozym 435 脂肪酶；將混合物置于50 ℃下磁力攪拌24 h，使阿魏酸接枝到藍(lán)莓花色苷分子上；反應(yīng)結(jié)束后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下除去混合液中的四氫呋喃，再用微孔膜（Φ=0.45 μm）過(guò)濾除去脂肪酶和未反應(yīng)的阿魏酸；通過(guò)冷凍干燥去除改性花色苷溶液中的水分，收集固體粉末，即為阿魏酸修飾花色苷，記為Fe-An。

用同樣的方法制備了咖啡酸酰化花色苷，記為Ca-An。

1.2.2 正辛醇/水分配系數(shù)測(cè)定 將100 mL 正辛醇與300 mL 超純水混合，恒溫?cái)嚢?4 h，靜置分層后將兩相液體分別保存，即水飽和正辛醇和正辛醇飽和水。取0.01 g 花色苷及改性花色苷，溶解于5 mL 水飽和正辛醇中，測(cè)定其吸光度為A0，加入5 mL 正辛醇飽和水，震蕩1 h 后，在3000 r/min 下離心10 min，取上層正辛醇，測(cè)定其吸光度A1[24]。

1.2.3 酰化度測(cè)定 參照Pinheiro 等[26?27]測(cè)定酰化花色苷的酰化度。取0.2 g 酰化花色苷加入20 mL 0.1 mo/L NaOH 溶液中，在60 ℃條件下攪拌90 min使花色苷水解并皂化；隨后，向混合溶液中滴加0.05 mo/L 和0.01 mo/L的HCl 直至pH 為8.5，所消耗HCl 體積分別記為V1和V2。按照下面公式計(jì)算花色苷的酸值（Acid Value,AV）和酰化度（Acylation Degree，AD）。

式中：m 為使用的花色苷質(zhì)量，為0.2 g；C0為0.1 mo/L，V0為20 mL；C1為滴定所使用鹽酸溶液的濃度，為0.05 mo/L，V1為該鹽酸溶液消耗的體積；C2為滴定所使用鹽酸溶液的濃度，為0.01 mo/L，V2為該鹽酸溶液消耗的體積。M 為接枝基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量，阿魏酰基為177 g/mol，咖啡酰基為163 g/mol。

1.2.4 總花青素含量測(cè)定 通過(guò)pH 差示法測(cè)定藍(lán)莓花色苷中的花青素含量[23]。將花色苷分別溶解于pH1.0 和pH4.5的緩沖液中，放在黑暗環(huán)境中靜置60 min，分別測(cè)定樣品在520 和700 nm 處的吸光度，按照公式（4）計(jì)算花青素含量。

式 中：吸光度值A(chǔ)=（A520nm?A700nm）pH1.0?（A520nm?A700nm）pH4.5；Mw 為矢車菊色素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）的相對(duì)分子量（449.2 g/mol）；ε為摩爾消光系數(shù)（26900 L·mol?1·cm?1）,DF 為稀釋因子（V/Wt）。

1.2.5 DPPH 自由基清除率測(cè)定 用無(wú)水乙醇稀釋0.25 mmol/L DPPH 自由基溶液，使其在513 nm 處吸光度約為0.8；取4 mL DPPH 自由基溶液置于7 mL 離心管中，用MultiSkan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定其在513 nm 處的吸光度，記為A0；向離心管中加入50 μL 花色苷溶液（250 mg/L），在黑暗中放置30 min后，再次測(cè)量其在513 nm 處的吸光度，記為A1[28]。

1.2.6β-胡蘿卜素漂白抑制率測(cè)定 向梨形瓶中10 mLβ-胡蘿卜素氯仿溶液（1 mg/mL）中加入400 μL 亞油酸和4 mL 吐溫80，混合均勻后在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿；在梨形瓶中加入100 mL 蒸餾水，將混合液攪拌均勻，形成乳化液；取10 mL 乳化液，用去離子水定容至100 mL，制得乳化稀釋液；將約0.2 mL的花色苷溶液加入到4.8 mL的乳化稀釋液中，混合均勻后測(cè)定470 nm 處相應(yīng)的吸光度；將樣品置于50 ℃恒溫水浴中，2 h 后，測(cè)定乳化液在470 nm 處的吸光度。對(duì)照樣品不加花色苷溶液，用70% 乙醇溶液代替。β-胡蘿卜素漂白抑制率計(jì)算如下[25]：

1.2.7 結(jié)構(gòu)表征 采用T9 紫外-可見(jiàn)分光光度儀（UV-Vis）對(duì)樣品進(jìn)行全波段掃描，掃描范圍200～800 nm，掃描步長(zhǎng)1 nm；采用NICOLET IS 10 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）測(cè)定花色苷的官能團(tuán)，測(cè)定波數(shù)范圍為4000～400 cm?1，分辨率為16 cm?1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的測(cè)試都重復(fù)三次并采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本檢驗(yàn)比較差異，當(dāng)P<0.05 時(shí)認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義存在顯著性差別，當(dāng)P<0.01 時(shí)認(rèn)為存在極顯著差別。

2 結(jié)果與分析

2.1 疏水性分析

本文用辛醇-水分配系數(shù)（KOW）來(lái)表征藍(lán)莓花色苷改性前后的疏水性變化。KOW 是指物質(zhì)在正辛醇和水兩相中的平衡濃度之比，其數(shù)值越大，物質(zhì)脂溶性也越大[24]。結(jié)果如圖1 所示，Na-An的KOW 值為?0.20，而Fe-An 和Ca-An的KOW 值分別上升至0.66 和0.78。這表明，經(jīng)阿魏酸和咖啡酸修飾后，花色苷的脂溶性顯著提高。這是由于阿魏酸和咖啡酸均為疏水性物質(zhì)，當(dāng)其接枝到花色苷分子上時(shí)，從而增強(qiáng)了該物質(zhì)的疏水性。

圖1 藍(lán)莓花色苷及酰化花色苷的辛醇/水分配系數(shù)Fig.1 KOW of native and acylated blueberry anthocyanins

2.2 酰化度和花青素含量分析

圖2 反映了藍(lán)莓花色苷與酰化花色苷的酰化度和花青素含量。如圖2（a）所示，F(xiàn)e-An 和Ca-An的AD 值分別為3.65 %和3.71%；兩種酰化花色苷之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。圖2（b）顯示，每克天然藍(lán)莓花青素含有370.2 mg的花青素（以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等量物表示），經(jīng)阿魏酸和咖啡酸修飾后，TAC 值分別降低至219.2 mg/g（Fe-An）和222.18 mg/g（Ca-An）。這主要是由于藍(lán)莓花色苷中外來(lái)基團(tuán)（阿魏酸或咖啡酸）的增加導(dǎo)致。此外，在酰基化反應(yīng)過(guò)程中，藍(lán)莓花色苷中的部分發(fā)色基團(tuán)被破壞或降解，也是導(dǎo)致酰化花青素的TAC 值低于未酰化樣品的一個(gè)原因。

圖2 藍(lán)莓花色苷及酰化花色苷的酰化度（a）和花青素含量（b）Fig.2 AD(a) and TAC(b) of native and acylated anthocyanins

2.3 抗氧化活性分析

以β-胡蘿卜素漂白抑制率和DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，測(cè)定藍(lán)莓花青素及其酰化衍生物的抗氧化活性。結(jié)果如圖3 所示，藍(lán)莓花色苷在DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)和β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。與阿魏酸和咖啡酸發(fā)生酰化反應(yīng)后，花色苷對(duì)DPPH 自由基的清除能力及對(duì)β-胡蘿卜素漂白的漂白抑制率進(jìn)一步提高[29]。這是由于阿魏酸和咖啡酸均含有有酚羥基，是良好的電子供體，可以通過(guò)提供電子清除溶液中的自由基。其中，阿魏酸分子上有一個(gè)酚羥基，而咖啡酸分子上有兩個(gè)酚羥基，因此，Ca-An 對(duì)DPPH 自由基的清除率高于Fe-An。

圖3 藍(lán)莓花色苷及酰化花色苷的DPPH 自由基清除率（a）和β-胡蘿卜素漂白抑制率（b）Fig.3 DPPH radical scavenging rate (a) and inhibition ratio in β-carotene bleaching assay (b) of native and acylated blueberry anthocyanins

Na-An 對(duì)DPPH 自由基的清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率分別為66.3%和63.1%，當(dāng)其接枝阿魏酸和咖啡酸后，F(xiàn)e-An 和Ca-An 對(duì)DPPH 自由基清除率分別上升了3.17%和12.67%，而β-胡蘿卜素漂白抑制率則分別上升了35.5%和43.1%。DPPH 自由基清除率是物質(zhì)在極性溶劑中抗氧化活性的指標(biāo)，而β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)中的抑制率反映了物質(zhì)在乳液環(huán)境中的抗氧化活性[10]。這表明，酰化花色苷在乳液體系中的抗氧化能力強(qiáng)于其在極性環(huán)境下的抗氧化活性。這一結(jié)果可能與藍(lán)莓花色苷在DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)和β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)中的作用機(jī)制不同有關(guān)[22?24]。在DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)中，花青素通過(guò)提供電子清除DPPH 自由基，而在β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)中，花色苷通過(guò)抑制脂質(zhì)氧化發(fā)揮作用。因此，在DPPH實(shí)驗(yàn)中，接枝到花色苷分子上的酚酸可以提供電子，并清除DPPH 溶液中的自由基，從而提高花色苷的抗氧化能力。在β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn)中，酚酸的引入改善了花色苷的脂溶性，使其可以更好地吸附在油酸表面，阻止油酸在加熱過(guò)程中被氧化而產(chǎn)生自由基，從而進(jìn)一步抑制了自由基對(duì)β-胡蘿卜素的漂白作用。

2.4 UV-Vis 分析

圖4 展示了天然藍(lán)莓花色苷酰化前后的UVVis 光譜。花色苷在UV-Vis 光譜中有兩個(gè)特征峰，分別位于500～540 nm（可見(jiàn)光區(qū)）和260～290 nm（紫外區(qū)）。Harborne[30?31]研究表明酰化花色苷在290～340 nm 處具有特征性吸收，這是由于酰基上的電子躍遷造成的。從圖4（a）中可以看出，天然藍(lán)莓花色苷在278 nm 處有一個(gè)特征吸收峰，經(jīng)阿魏酸和咖啡酸修飾后，該特征峰紅移至283 nm。于此同時(shí)，改性花色苷在320 nm 處出現(xiàn)了一個(gè)吸收峰，這是花色苷上的酰基造成的。這表明阿魏酸和咖啡酸通過(guò)酰化反應(yīng)接枝到花色苷分子上。

圖4 藍(lán)莓花色苷及酰化花色苷的UV-Vis 圖譜Fig.4 UV-Vis spectra of native and acylated anthocyanins

另外，在圖4（b）中可以觀察到，經(jīng)阿魏酸和咖啡酸修飾后，藍(lán)莓花色苷在可見(jiàn)光區(qū)的特征峰吸光度降低并發(fā)生藍(lán)移，這可能是由于接枝到花色苷分子上的酚酸與花色苷母核（2-苯基并吡喃）產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)造成的。以上結(jié)果表明，在脂肪酶的作用下，阿魏酸和咖啡酸通過(guò)酰化反應(yīng)接枝到花色苷分子上。

除此之外，在圖4（b）的440～460 nm 區(qū)域可以觀察到明顯的肩峰，這表明花色苷中糖苷替代的位置在C3 位置[30?31]，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道的一致。

2.5 FTIR 光譜分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證藍(lán)莓花色苷與阿魏酸及咖啡酸之間的酰化反應(yīng)，通過(guò)FTIR 表征了藍(lán)莓花色苷酰化前后分子基團(tuán)的變化。圖5（a）中，藍(lán)莓花色苷及酰化花色苷3134 cm?1處均有一個(gè)寬且強(qiáng)的吸收峰，這是花色苷苯環(huán)中的酚羥基和H2O 中-OH 及氫鍵的伸縮振動(dòng)造成的，1400～1650 cm?1處的多個(gè)吸收峰是由苯環(huán)的骨架振動(dòng)造成的。圖5（b）中，藍(lán)莓花色苷在1730 cm?1處有一個(gè)吸收峰，這是C=O的伸縮振動(dòng)造成的。經(jīng)阿魏酸和咖啡酸修飾后，花色苷在該處的吸收峰紅移至1700 cm?1，且吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)并發(fā)生紅移。這是由于阿魏酸和咖啡酸與花色苷發(fā)生了酯化反應(yīng)造成的。一般而言，ArCOOR 上的C=O 會(huì)因?yàn)楸江h(huán)的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致其吸收峰移向大波數(shù)，而芳香酯（RCOOAr）上的C=O 吸收峰因?yàn)榕cC=C 吸收峰共軛，使其吸收峰發(fā)生紅移。由此可以推斷，阿魏酸和咖啡酸分子上的-COOH 與花色苷分子上糖基的-OH 發(fā)生了酰化反應(yīng)，生成了ArCOOR結(jié)構(gòu)，造成了C=O 吸收峰的紅移現(xiàn)象。

圖5 藍(lán)莓花色苷及酰化花色苷的紅外光譜圖譜Fig.5 FTIR spectra of native and acylated anthocyanins

3 結(jié)論

花色苷作為一種具有良好抗氧化活性的天然色素，其脂溶性較差是阻礙其在油脂中應(yīng)用的最大障礙之一。為了解決這一問(wèn)題，本研究通過(guò)酶法將阿魏酸和咖啡酸接枝到藍(lán)莓花色苷分子上，以提高其疏水性。相較于化學(xué)酰化法，酶法酰化的反應(yīng)條件相對(duì)溫和，且副產(chǎn)物較少。研究結(jié)果表明，UV-Vis 和FTIR分析表明，在脂肪酶的作用下，這兩種酚酸接枝到了花色苷分子上，花色苷中的接枝位點(diǎn)可能主要是花色苷糖基上的-OH。KOW 實(shí)驗(yàn)表明，酚酸的引入顯著提高了藍(lán)莓花色苷的疏水性。

另外，與天然藍(lán)莓花色苷相比，酰化花色苷的DPPH 自由基清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率均顯著提高。這是由于一方面，阿魏酸和咖啡酸分子上的酚羥基可以提供電子以清除自由基。另一方面，酰化花色苷中的的酚酸可以吸附在亞油酸分子上，抑制其在高溫下氧化，阻礙自由基的生成。