一株產羧酸酯酶菌的鑒定及酯酶特征的研究

張 杰，侯珺淇，代振玉，趙 新，侯小歌

（周口師范學院生命科學與農學學院，河南周口 466001）

中國白酒與西方白酒不同。中國白酒的發酵原料、發酵劑、發酵方式、生產方式、發酵期、發酵設備、蒸餾設備、貯藏設備、貯藏時間和勾兌調味與其他蒸餾酒（西方的威士忌和白蘭地）區別較大[1]；中國白酒發酵的獨特過程是雙邊發酵。它通常以酒曲為起曲，在固態條件下發酵。與西方釀造使用麥芽酶不同，酒曲是多種外源微生物產生的酶推動白酒發酵；酒曲不僅決定了白酒發酵的微生物群體及其酶類，而且對白酒風味的形成具有顯著的作用，故酒曲發酵劑的獨特應用不用于其他白酒[2]；同時糖化和自發發酵過程中淀粉轉化為糖及酯類的轉化對白酒風味的形成至關重要。固態發酵條件下，微生物的酯化酶產物決定了中國白酒的獨特風格[2]。

濃香型白酒中的酯是具有合成和分解的雙功能分子。催化酯的合成和分解的酶類即是濃香型白酒發酵產生的羧酸酯酶（酯酶，Esterase）。它是催化濃香型白酒主體香味物質（己酸乙酯）形成的主要酶類。決定白酒風格的重要指標之一就是酯類。因此酶在白酒生產中具有重要地位[3]。紅曲酯化菌種參與酒醅發酵后，產出的原酒更具有“窖香突出，幽雅細膩，酒體醇厚，回味悠長”的特點，表明羧酸酯酶產生的己酸乙酯、乳酸乙酯能夠改善酒體風格，提高酒的品質[4]。已有研究表明存放4 個月的濃香型白酒大曲總的酯化力達到最高[5]。五糧液大曲中的紅曲霉菌株產己酸乙酯酯化酶[6]。中高溫大曲中也曾分離出己酸乙酯酯酶活力高達6.7 U/mL的細菌[7]。汾酒大曲中分離到的黑曲霉菌高產己酸乙酯和己酸乙酯的酯化酶[8]。大曲中分離出的芽孢菌的己酸乙酯酯化酶活力達到22.83 U/mL[8]。分析白酒中酯的合成和分解機制，有利于解決白酒中乳酸乙酯含量過高的問題[9?10]。不同香型白酒總大曲酯化酶的催化特性各有特性，且每種酯的合成都有各自的最適酸濃度和pH 值[11?12]。綜上所述表明研究對酯化酶產生菌的分離和作用機制的研究對中國白酒的生產具有較高的經濟和質量價值。

白酒發酵過程中認識必須基于微生物的分類和鑒定。一般來說，細菌類的鑒定常采用表型、生化和免疫學檢測和分子方法[13]。然而，當區分環境相同，密切相關的物種時，這些技術的分辨率很差，往往導致菌株的錯誤分類和錯誤識別。多年來，16S rRNA基因被用來描述各種環境中微生物組成。基于16S rRNA 基因測序的分子分析是包括枯草桿菌、地衣菌和貝萊斯芽胞桿菌物種分類鑒定和系統發育樹構建的主要工具[14]。然而，16S rRNA 基因序列沒有顯著性差異物種，因此，用這些檢測方法在芽孢桿菌群的鑒定和檢測中存在顯著的缺陷。這些技術限制已成為阻礙闡明各種食品樣品微生物群落的一個重大障礙。在芽孢桿菌菌株的基因組序列中識別特有的基因，進一步鑒定菌株的分類群是特別有效的方法[15]。它在不同環境中識別芽孢桿菌物種時，具有更高保真度、更快和更具成本效益特點的技術。普遍存在的，被認為是安全的，形成內孢子的芽孢桿菌群體之貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）在食品工業中作為生物資源受到廣泛的關注。目前濃香型白酒發酵微生物中的貝萊斯芽胞桿菌的檢測、鑒定及其酶學機制尚無報道。

篩選并鑒定酯化酶產生菌并闡述酶特征能為提高大曲品質與白酒的優質品率提供基礎。故在本研究中，基于16S rRNA 序列，gyrB和菌株的代謝物基因簇工具鑒定分離出的產酯酶細菌。在此基礎之上，研究篩選出的目標菌的生物學和酶學特性，通過分子對接的方法分析酯化酶的分子作用機制。以此指導提高大曲品質和白酒的優質品率，并為揭開中國白酒發酵背后的奧秘提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫大曲 宋河酒業有限公司；葡萄糖、蛋白胨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鉀、硫酸錳、三丁酸甘油酯、瓊脂粉、α-萘酚、考馬斯亮藍G250 等試劑 均為國產分析純。

ZWY-1102C 恒溫培養箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；2720 thermal cycler PCR Life technologies 公司；TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計 北京譜析通用儀器有限公司；LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；Dry 2black 數字金屬浴 Thermo Scientific 公司；BX43顯微鏡 日本奧林帕斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.2 菌株的鑒定 將菌株劃線在三丁酸甘油酯瓊脂平板上，在30 °C 下培養48 h，研究菌落形態。取24 h 培養的瓊脂平板上的菌體進行革蘭氏染色，分析菌體形態。取純培養的菌落配成菌懸液用作PCR 擴增模板，用通用引物27F（AGAGTTTGATC MTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTA CGACTT）對16S rRNA 基因進行擴增和測序，登錄號為（SUB9040179）。gyrB基因的擴增引物為gyrBF（′GAAGTCATCATGACC′）和gyrBR（′AGCAGGG TACGGAT′）。菌株的全基因組序列在NCBI 中的登錄號為CP044133。用軟件DNAMAN 分析了全基因組核苷酸序列的GC 含量。菌株的代謝物基因簇的預測分析工具為antiSMASH bacterial version（anti-SMASH,https://antismash.secondarymetabolites.org）。

1.2.3 生物信息學分析 根據上述的測序文件，用NCBI 在線blastn 比對，并鑒定分離到的羧酸酯酶分解菌，利用軟件MEGA7 軟件中Neighbor-joining 法分析其同源關系[12]。根據NCBI 比對出的-羧酸酯酶蛋白序列，利用軟件MEGA7 軟件中Neighborjoining 法分析-羧酸酯酶氨基酸序列上的同源關系。

根據NCBI 上下載的羧酸酯酶序列采用Multiple Em for Motif Elicitation（http://meme-suite.org/）在線預測其Motif，并用軟件TBtools 進一步與同源合并，且可視化[13－14]。

1.2.4 羧酸酯酶提取 將經搖床發酵培養48 h（37 ℃、160 r/min）液體培養基取出，經離心（4 ℃、5000 r/min）20 min 去沉淀，上清液即為粗酶液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.5 酯化酶的蛋白質定量和活性測定 以牛血清白蛋白為校準標準，用Bradford 法測定粗提取的粗酶液濃度。在595 nm 處測定其吸光度。酯化酶活性的分析采用分光光度法[15]。反應條件是將提取的粗酶液，接入到50 mmol/L Tris-HCl pH7.0 緩沖液中，三丁酸甘油酯含量為0.2%，25 ℃ 10 min。然后樣品煮沸5 min，用紫外-可見分光度計讀取595 nm的吸光度。酯化酶活性的一個單位被定義為在測定條件下每分鐘1.0 mg 三丁酸甘油酯所需的酶量。所有實驗都做三次重復。

1.2.6 貝萊斯芽胞桿菌的生物學和羧酸酯酶特性

1.2.6.1 貝萊斯芽胞桿菌的生物學 用分光光度計讀取560 nm的吸光度為菌體的濃度定量。

1.2.6.2 貝萊斯芽胞桿菌的羧酸酯酶特性 a.金屬離子對酯化酶活性的影響：提取的羧酸酯酶接種到包含金屬離子或化學試劑的淀粉混合溶液中，金屬離子的濃度分別為1 mmoL/L［Ca2+（CaCl2）,Mg2+（MgCl2）,Fe2+（FeCl2）,Na+（NaCl）,K+（KCl）］[11]；酶的活性按照1.2.5 所述的方式測定，并以相對活性的百分比表示，沒有任何添加物的反應為空白對照。

老師課前導入本節課的學習目標、重點難點，然后設定龍虎榜（評分表）用以記錄每個組的得分，激發學生勝負欲望。接著邀請各組派代表對收集到的產品資料進行介紹，老師在黑板上把學生提及的產品信息點列出來。最后由老師進行劃重點和歸納，就形成了產品說明書的基本要素。

b.pH 對酯化酶活性的影響:pH 對酯化酶活性影響的測定范圍為pH2.0～10.0的范圍，在50 mmol/L不同pH的緩沖液中反應[16]。將酯化酶接入到0.2%的三丁酸甘油酯液體培養基中，25 ℃反應10 min。反應前酯化酶在25 ℃的緩沖液中預熱1 h，孵育時，pH 調至7.0。酯化酶活性的計算為消耗三丁酸甘油酯的量相對起始含量的百分比（25 ℃，10 min，pH7.0）。所有實驗做三次重復。

1.2.7 羧酸酯酶的分子對接 以16S 100%同源同屬同種菌株（Bacillus velezensisFJAT-46737,CP044133）的全基因組為模板，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）在線建模的方式預測-羧酸酯酶的3D 體結構，并下載相應的PDB 文件[17?21]。上述的蛋白序列和羧酸酯酶模型上傳到ESPript（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）在線分析并生成Aligment 與相應的結構[21]。

根據蛋白質數據庫提供的信息（https://www.rcsb.org/），用ChemDraw Professional 17.0（https://www.chemdraw.com.cn/）繪制三磷酸甘油酯（lCID_6050）的配體結構，并用Chem3D 17.0 將三磷酸甘油酯的化學結構轉化為pdb 格式的三維結構。用Chem3D 17.0 軟件去除-羧酸酯酶的水和不相關的極性原子和配體，獲得穩定和有效的受體。在線預測（https://www.d3pharma.com/D3Pocket/index.php）-羧酸酯酶的活性中心[22]。

用Chimera 插件的AutodockVina 預測了配體合與受體的結合模式。分子受體綁定過程、鍵的作用力和動畫生成采用USCF Chimera 1.13.1rc（http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）軟件中的默認參數生成。用PyMOL 軟件繪制-羧酸酯酶的三維結構（https://pymol.org/2/）、活性中心和受體與配體作用的氫鍵[23]。用軟件PoseView1.1.2 生成配體與受體催化位點的氫鍵平面圖[24]。

1.3 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 19.0 軟件用單因素ANOVA 方差分析，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著，大寫字母代表極顯著性差異，小寫字母代表顯著性差異。。

2 結果與分析

2.1 羧酸酯酶產生菌的分離和鑒定

形態學觀察結果顯示分離的菌株菌落形態為圓形，生長初期表明光滑兼有莢膜，后期菌落表面有褶皺（圖1A，B）。革蘭氏染色顯示為陰性，棒狀（圖1C）。菌落PCR 擴增出16S rRNA 序列測序結果優良（MW580690），16S rRNA 序列的blastn 結果表明其與貝萊斯芽胞桿菌相似性達到了100%；用16S rRNA 序列構建的系統發育樹結果顯示其與貝萊斯芽胞桿菌群體處以相同分支（圖1D）。同樣地，gyr B基因blastn 結果表明其與貝萊斯芽胞桿菌相似性達到了100%；故認為該菌株屬于貝萊斯芽胞桿菌家族成員。初步認為該菌株為貝萊斯芽胞桿菌（編號Pb1，MW580690）。

圖1 微生物的分離和鑒定結果Fig.1 Isolation and identification of the strain

采用antiSMASH 法分析了該菌株生物活性代謝產物的基因簇。結果表明該菌株具有12 個基因簇，分別負責合脂肽、丁酰苷菌毒素A/B、2 個萜烯族群、硫肽化合物、催乳素H、芬枯草菌素、3 個聚酮合酶類、地非西丁、桿菌肌動蛋白、桿菌溶素（圖2A紅色方框）。羧酸酯酶（carboxylesterase）處于脂肽基因簇中的其它基因簇中（圖2A，B 藍色方框），并且該簇基因與貝萊斯芽胞桿菌數據庫中的其它基因簇的相似率達到了100%（圖2C）。這些結果表明Pb1 是具有酯化基因的菌株。

圖2 菌株生物活性次生代謝產物基因簇的預測Fig.2 Analysis of the secondary metabolite gene clusters of the strain

2.2 貝萊斯芽胞桿菌羧酸酯酶的蛋白序列分析

根據上述16SrRNA 鑒定結果，以NCBI 蛋白數據庫為模板，獲得自己菌株的羧酸酯酶；羧酸酯酶氨基酸分析結果顯示其同源性大于35%，即表明羧酸酯酶蛋白序列在芽孢桿菌中相對保守（圖3A 左）；Motif 分析結果表明本研究與數據庫中的羧酸酯酶均含有5 個保守基序，結構相似，且在蛋白序列中的位置保守（圖3A 右），本研究的羧酸酯酶前四個Motif的氨基酸序列最為保守（圖3B a,b,c,d）。

圖3 羧酸酯酶的氨基酸序列同源性和Motif 分析Fig.3 Homology analysis of amino acid se-quences and motif of carboxylesterase

二級結構表明羧酸酯酶有9 個α螺旋，7 個β折疊，1 個稀有的無規則卷曲，其余為環狀結構，4 個保守的Motif 位于序列的前端，其可能的催化位點為Phe（圖4 綠色方框）。這與羧酸酯酶的同源性結果分析相一致。表明可用該酶的氨基酸序列進一步查詢其晶體結構，并進行分子動力學分析。

圖4 羧酸酯酶的序列比對和結構分析Fig.4 Analysis of sequence and structure of car-boxylesterase

2.3 貝萊斯芽胞桿菌的生物學和羧酸酯酶特性分析

液體搖瓶培養結果顯示該菌在三丁酸甘油酯液體培養基內的生長曲線如圖5A 所示，接種后的6～36 h 內是其指數生長期，36 h 后進入平穩期。其產物曲線呈現單“S”型曲線，接種4～24 h 時間段內為指數期，26 h 后蛋白產量進入到平穩期（圖5B）；金屬離子敏感性實驗表明羧酸酯酶活性顯著的受Fe2+、Na+、K+和Mg2+限制（圖5C）。pH 耐性實驗結果顯示該酶具有較寬的環境適應性，pH5～ 9的范圍內，酶活性不受影響（圖5D）。上述結果表明該菌株能在接種26 h 后達到產羧酸酯酶穩定期，能在較寬pH 范圍內保持酶的活性，培養時加入合適的金屬離子時可以提升發酵液羧酸酯酶活力。

圖5 貝萊斯芽胞桿菌的生物學和羧酸酯酶特性Fig.5 Biological and carboxylesterase characteristics analysis of Bacillus velezensis

2.4 貝萊斯芽胞桿菌羧酸酯酶的分子對接

根據其相似的蛋白序列進行了在線建模。建模形成的拉氏圖顯示其蛋白序列與模板（PDB:6nkg.1）序列的相似性達到88.16，GMQE 值為0.90，QMENA值為?0.01。這些結果表明進入最大允許區（深綠色區域）和允許區（圖中淺綠色區域）的氨基酸殘基占整個蛋白質的比例為99.7 %，構象處在立體化學允許區，可以穩定存在。建模結果要求與模型獲得分值適合于下一步分子對接（表1）。故認為該模型的構象符合立體化學規則（圖6A 和B）。故下載該模型的PDB 格式進行分子對接。D3Pockets 預測到該蛋白有6 個活性中心，其相應的參數如表2 所示。

表1 蛋白三維建模評分標準Table 1 Index of score of model building

表2 活性中心預測評分Table 2 Results of active center score

最有可能的活性中是1 和2 層級或兩者兼而有之。其中紅色區域為構象最穩定的活性中心P2 或P1（圖6C）。靜電力學分析顯示該活性中配體處于一個疏水性為主的空間（圖6D）。故以紅色區域為中心，執行配體與受體對接，對接結果顯示三丁酸甘油酯分子與羧酸酯酶形成了五個構象變化，其中在預測的活性中心P2 處形成的構象評分最為合理（Score=?5.3,RMSD 1.b.=1.446,RMSD u.b.=5.642,表3 所示）。

表3 對接評分結果Table 3 Results of molecular docking score

以最佳構象進行分子動力學模擬發現配體在活性中心以氫鍵、非配位鍵和疏水性與受體作用形成了三丁酸甘油酯的穩定構象。主要的配對的氫鍵及鍵長信息分別如下：Phe21A<->T 1.C O4:3.20 ?（圖6E左）。另外參與非配位鍵形成疏水作用的受體氨基酸分別為：Pro114（A），Met123（A），Gly126（A），Met191（A），Val120（A），Leu223（A），His219（A），Asp27（A）（圖6E 右）。模擬過程發現預測活性中心P1 為配體進入酶活性中心的初始口袋即“界面活化”作用，經過構象變化進入活性中心P2，即是催化三位一體中心；在羧酸酯酶活性中心，Phe 作為氫鍵能量轉化供體與周圍的疏水作用力共同作用把三丁酸甘油酯分解為丁酸和甘油（圖6E 綠色箭頭所指）。

圖6 貝萊斯芽胞桿菌羧酸酯酶建模和分子對接Fig.6 Model building and molecular docking of carboxylesterase

3 討論

以酒曲作為起始發酵劑。酒曲不僅決定了白酒發酵的主要微生物聯合體及其酶類，而且對風味形成也至關重要。一般來說，微生物的檢測、定量和鑒定常采用表型、生化和免疫學檢測和分子生物學的方法。然而，當區分密切相關的物種時，這些技術的分辨率很差，往往導致菌株的錯誤分類和錯誤識別[16]。故采用16S rRNA 序列、gyrB基因和完整基因組序列活性代謝產物分析相結合的方法區分這些物種。本研究認定分析出具有羧酸酯酶基因的Pb1 為貝萊斯芽胞桿菌。貝萊斯芽胞桿菌是稻田中植物相關或發酵食品中最常見的桿菌[25]。白酒大曲中的該菌株可能隨發酵原料大米或糯米進入了發酵過程。

全基因組比對分析結果表明Pb1 具有羧酸酯酶基因，該基因處于12 個基因簇的其它基因簇中（圖2A，B 藍色方框），且該基因簇與貝萊斯芽胞桿菌數據庫中其它基因簇的相似率達到了100 %（圖2C）。同源性鑒定、蛋白質功能、結構和相互作用預測、計算機輔助誘變、系統發育分析等是解決生物學問題的好方法[26]。對貝萊斯芽胞桿菌的蛋白數據庫的比對獲得羧酸酯酶（ASK60660.1）的蛋白序列，并且通過同源比對和Motif 結構分析進一步獲得證實（圖3）。二級結構分析結果表明羧酸酯酶有9 個α螺旋，7 個β折疊，1 個稀有的無規則卷曲，其余為環狀結構，4 個保守的Motif 位于序列的前端，其可能的催化位點為Phe（圖4 綠色方框）。羧酸酯酶（ASK 60660.1）的蛋白序列三維建模結果表明模型與模板（PDB:6nkg.1）序列的相似性達到88.16，GMQE 值為0.90，QMENA 值為?0.01。一般建模結果要求[27]與模型獲得分值適合于下一步分子對接。

菌株的生物學實驗和酶學特性實驗表明該菌株的生長曲線呈 “S”型，接種26 h 后，羧酸酯酶產量達到穩定期，培養時需注意合適的金屬離子能提高該酶的活性。具有較寬的pH 環境適應性。酒曲中pH 為3.0 時，羧酸酯酶表現為分解作用，pH 為4.5 時，最適合成己酸乙酯[10]；pH 在3.0～6.0 范圍內時，羧酸酯酶表現為最適合成乳酸乙酯；羧酸酯酶合成丁酸乙酯的最適pH 為4.5；大曲羧酸酯酶催化合成乙酸乙酯最適pH 為4.5；大曲羧酸酯酶催化合成乳酸乙酯的最適pH 為6.0；丁酸乙酯酶類的最適pH 為4.0～4.5[11]。也有文獻報道清香型、濃香型和醬香型大曲催化合成丁酸乙酯的最適pH 分別為4.5、4.0 和3.0[9]。上述結果表明酒曲微生物產生的羧酸酯酶可能是兩性分子或多性分子，在不同條件下發揮不同的功能，形成了不同香型的白酒風格。濃香型白酒中的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯四大酯類的比例是濃香型白酒質量的關鍵問題之一。丁酸起到豐富酒體的作用，它由生香功能菌丁酸菌產生。白酒中的丁酸乙酯過高會產生酒體不協調，欠爽凈。丁酸乙酯是由丁酸菌或己酸菌產生的丁酸與乙醇經生化反應而合成[28]。故本研究推斷該菌產生的羧酸酯酶具有平衡酒體中的丁酸和丁酸乙酯的功能，在協調酒體風味時具有重要作用。在丁酸乙酯過多時，將其分解其為丁酸和乙酯。控制pH的同時，適量添加金屬離子對于控制乳酸乙酯和乙酸乙酯含量，進而達到生產上達到了“增己降乳”要求[12]。

分子對接研究可以提供配體-蛋白質結合強度以及配體結合模式和機制的重要見解[28]。為了進一步闡明羧酸酯酶在中國白酒中的分子機制而進行了分子對接。事實上，對酶表面先前底物識別和定位的化學理解仍然缺乏，同時對揭示酶的功能也有相當大的興趣[29]。建模模型和三丁酸甘油酯對接結果顯示三丁酸甘油酯經過五次構象變化，經過預測到的兩個口袋中心，最后定位到催化三位一體的活性中心。然后底物分子經過Phe21A 提供氫供體催化水解后，從Met115A 到Glu120A（α螺旋4 和β折疊5 結合處，圖4、圖6）氨基酸所組成的覆蓋的疏水性通道轉移到酶表面（圖7）。這與Lucia 報道的作用方式相一致[30?31]。

圖7 羧酸酯酶疏水性通道Fig.7 Hydrophic cave of carboxylesterase

4 結論

本研究證實了一株具有羧酸酯酶功能的芽孢桿菌為貝萊斯芽胞桿菌；該菌株呈現S 型生長曲線，產物曲線也為S 型，羧酸酯酶活化pH 范圍是pH5～9。采用分子建模的方法獲得了羧酸酯酶的3D 模型。分子動力學模擬發現Phe21A 為該酶的催化活性氨基酸，分解三丁酸甘油酯為丁酸和甘油。總而言之，該菌的羧酸酯酶具有平衡酒體中的丁酸和丁酸乙酯的功能，在協調酒體風味時具有重要作用。在發酵過程中何時促進該菌的增加，何時抑制需要在實踐中解決。在增己降乳時如何控制該菌的數量，確保酒體質量也是需要解決的現實問題。