基于高通量測序解析四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中細菌群落變化

馮潔雅，張桂容，蔡 吉，劉 軍,2，溫雪瓶,2，劉雪嬌，附俊杰，李 麗,2,（.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術工程實驗室，四川宜賓 644000）

四川曬醋屬于我國“四大名醋”[1]之一的四川麩醋，它是以麩皮、大米為主要原料，沿用歷史傳統(tǒng)秘方的釀制技藝，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、日曬（其醋醅和醋液均需經(jīng)自然條件下曬制）和陳釀四大工藝流程，20 多道工序制成，故而簡稱“曬醋”。具體工藝流程見圖1。其產品色澤黑褐、無沉淀、香氣芬芳，具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長、久存不腐的特點[2?3]。距今已有160 余年的生產歷史，經(jīng)幾代釀造技師（掌缸師）的不斷探索、挖掘、整理和傳承，該釀制技藝已獲得“省級非物質文化遺產”的稱號。

圖1 四川曬醋生產工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of Sichuan Sun vinegar production

我國歷史上的“四大名醋[4?10]”除了福建永春紅曲醋[11]采用液態(tài)發(fā)酵外，其他三種名醋均采用固態(tài)發(fā)酵的方式；四川曬醋以麩皮為主要釀制原料，固態(tài)開放式多菌種混合接種，輔以獨特的藥曲配方，采用糖化、酒化、醋化同池進行（俗稱：三邊同池發(fā)酵）發(fā)酵，形成獨特微生物群落結構，這是區(qū)別于其他食醋之根本所在[12]。但是當前對曬醋發(fā)酵過程中微生物群落結構的變化及其代謝機理的研究不足，不利于非物質文化的傳承，也不利于四川曬醋的規(guī)模化生產和產品創(chuàng)新，因此迫切需要對四川曬醋的發(fā)酵過程進行探索，了解其微生物群落結構變化及其規(guī)律。

近年來，隨著分子生態(tài)學技術的迅速發(fā)展，高通量測序技術（High-throughput sequencing）代替了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和分離技術，一次對樣品中幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，可快速確定其中微生物的種類和豐度[13?15]，分析速度快、結果精準，因而特別適合對復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)的區(qū)系結構進行連續(xù)動態(tài)分析，在與微生物群落變化相關的所有產業(yè)領域都具有廣泛的應用前景[16?18]，該技術也成為了研究微生物生態(tài)的首選方法。

綜合目前國內對食醋的研究狀況分析[19?26]，利用高通量測序技術對四川曬醋的研究還未見報道，且尚無對四川曬醋微生物群落分析的研究，尤其是對四川曬醋的微生物群落變化、功能菌等方面的研究。因此，利用高通量測序技術研究四川曬醋微生物群落結構變化及其規(guī)律，為了解微生物群落結構的多樣性，探索優(yōu)勢微生物及其代謝機理提供了理論基礎，也為四川曬醋的改革和行業(yè)發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固態(tài)發(fā)酵過程中的醋醅 取自四川某曬醋廠，取樣時間以隔天取樣計，分別為1、3、5、7、9、11、13、15、17 d，共9 個樣品(分別標記為P1,P3，…P17)。每個樣本采用三點取樣，如圖2 所示，將上面的三個樣本混合均勻，取500 g 樣本用無菌塑料袋收集，低溫運回實驗室，并于?20 ℃冰箱保存。

圖2 醋醅取樣點分布圖Fig.2 Distribution of sampling sites in Cupei

DNA Marker 大連Takara 公司；細菌DNA 提取試劑盒 杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；OmegaDNA 提取試劑盒、10×PBS 緩沖液（pH7.4）北京全式金生物技術有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 北 京 NEB 公 司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 賽默飛公司；TE412-L 精密電子天平 北京賽多利斯儀器公司；AT-710 電位自動滴定計 日本精度電子制造有限公司；MT-5000 pH 計 上海三本環(huán)保科技有限公司；Eppendorf N13462C 移液器 德國Eppendorf 公司；Illumina MiSeq 測序儀 美 國 Illumina 公 司；2720 型PCR 儀 ABI 公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一儀器廠；BioTek ELx800 酶標儀 美國Biotek;TGL 高速冷凍離心機 長沙湘儀儀器有限公司；Agilent 5977B 高效液相色譜儀、7890A-5975B 高效氣相色譜質譜儀 安捷倫（中國）公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 理化指標測定

1.2.1.1 溫度的測定 在發(fā)酵池中用溫度計每天早晚各檢測一次，取平均值[27]。

1.2.1.2 pH 測定 取10 g 醋醅樣品加入30 mL 水中混勻后，用pH 計測定濾液pH[4]。

1.2.1.3 酸度測定 酸度的測定參照GB 5009.239-2016 食品安全國家標準 食品酸度的測定。

1.2.1.4 還原糖測定 采用3,5-二硝基水楊酸鹽法[28]。

標準曲線的繪制：首先分別取葡萄糖標準溶液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于帶刻度的試管中，用蒸餾水補足至1.0 mL，分別加入DNS 溶液2 mL，煮沸2 min，冷卻后用水補足至10 mL 刻度線，在540 nm 下測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品前處理：稱5 g 樣品加100 mL 水，浸泡30 min，過濾。

樣品測定：取上述濾液1 mL，加入DNS 溶液2 mL，煮沸2 min，冷卻后用水補足至10 mL 刻度線，在540 nm 下測定吸光度。根據(jù)標準曲線換算還原糖含量，表示為（mg 葡萄糖/mL）。計算公式如下：

式中：X0為樣品中還原糖的含量（以葡萄糖計），mg/g；M0為稱取的樣品質量，g；M0為由樣品液吸光度從葡萄糖標準曲線中查得的葡萄糖濃度，mg/mL；100 為樣品中加入水的體積。

1.2.1.5 游離氨基氮測定 采用GB/T 5009.39-2003醬油衛(wèi)生標準的分析方法中的甲醛滴定法。

樣品前處理：稱取5 g 樣品加100 mL 水，浸泡30 min，過濾。

吸取5.0 mL 上述樣品稀釋液，置于100 mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0 mL,置于200 mL燒杯中，加入60 mL 水，開動磁力攪拌器，轉速為1000 r/min，用氫氧化鈉標準溶液（0.05 mol/L）滴定至pH8.2，記下消耗的氫氧化鈉體積。向其中加入甲醛溶液10.0 mL，混勻后，繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積。同時取80 mL水，先用氫氧化鈉溶液（0.05 mol/L）調節(jié)pH 為8.2，再加入10.0 mL 甲醛溶液，用氫氧化鈉標準滴定溶液（0.05 mol/L）滴定至pH9.2，同時做空白試驗。計算公式如下：

式中：X 為樣品中氨基酸態(tài)氮的含量（以氨計），g/kg；V 為滴定樣品稀釋液消耗0.05 mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V0為空白試樣消耗0.05 mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V1為樣品稀釋液取用量，mL；c 為氫氧化鈉標準滴定溶液濃度，mol/L；0.014 為1.00 mL 氫氧化鈉標準滴定溶液[c（NaOH）=1.000 mol/L]相當于氨的質量，g。

1.2.2 乳酸和乙酸含量測定

1.2.2.1 樣品處理 稱取10 g 醋醅，加30 mL 超純水浸泡3 h，過濾后取濾液25 mL 并加入1 mL的亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和1 mL的硫酸鋅（300 g/L）溶液，用超純水定容至100 mL，混勻后靜置1 h，取上清液過0.22 μm 濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液供HPLC 分析用[29]。

1.2.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：20 mmol/L NaH2PO4（pH2.7），比例為100%；流速：0.5 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；紫外檢測器波長：210 nm。

1.2.2.3 標準曲線及線性回歸方程 分別精確稱取乳酸和乙酸標品10 mg 溶于10 mL 超純水中，混勻后作為母液，依次從母液中取0、2、4、6、8、10 mL，分別定容到10 mL，使得終濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，在相同的色譜條件下進樣，繪制標準曲線[30]。

1.2.2.4 定量方法 根據(jù)標準品的出峰時間和出峰面積對樣品進行定性和定量分析。

1.2.3 乙醇含量測定

1.2.3.1 樣品處理 分別稱取醋醅固體樣品2 g 置于10 mL的頂空萃取瓶中，加入2.5 g NaCl 進行飽和，同時加入15 μL（8.4×10?4mg/L）的2-辛醇作為內標，根據(jù)峰面積比對進行定量；萃取瓶于50 ℃水浴預熱10 min，萃取針經(jīng)230 ℃老化處理30 min 后插入萃取瓶，保持50 ℃恒溫水浴條件下萃取40 min，之后將萃取針插入GC-MS 分析儀進樣口，解析5 min，采集樣品數(shù)據(jù)[30]。

1.2.3.2 色譜條件 色譜柱DB-WAX（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為高純He，流速1 mL/min,進樣口溫度230 ℃；程序升溫：初始溫度35 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min 升至130 ℃保持1 min，再以5 ℃/min升至150 ℃保持2 min，最后以8 ℃/min 升至230 ℃保持1 min，總共運行時間為38 min。

1.2.3.3 質譜條件 電子電離源（EI），70 eV 電子能量，采集模式為全掃描，質量范圍20～550 u，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃。

1.2.4 總DNA 提取及擴增

1.2.4.1 樣品預處理 取2 g 醋醅樣品于20 mL 10×PBS 緩沖液（pH7.4）中懸浮，在振蕩器上充分振蕩5 min，離心5 min（500×g，4 ℃）后收集上清液，將沉淀繼續(xù)用PBS 緩沖液洗滌兩次后收集上清液，將所有上清液再次離心10 min（12000×g，4 ℃），收集沉淀，用1 mL 10×PBS 緩沖液重懸沉淀轉入1.5 mL的PE 管中，?20 ℃保存[31]。

1.2.4.2 DNA 提取 根據(jù)Omega 試劑盒的使用說明書，對樣品進行總DNA的提取，將獲得的總DNA 通過1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，同時采用紫外分光光度計對回收后的DNA 進行定量。瓊脂糖凝膠電泳檢測參數(shù)如下：Marker 上樣量5 μL，樣品上樣量5 μL，電泳時間20 min，瓊脂糖濃度1.20%，電壓120 V，恒壓，電流約80 mA。

1.2.4.3 PCR 擴增及測序 采用通用引物P1（ACTCC TACGGGAGGCAGCA）和P2（GGACTACHVGGGT WTCTAAT）對細菌16S rRNA 基因進行擴增。

PCR 樣品均勻稀釋至20 ng/L，擴增體系（25 μL）：5×reaction Buffer 5 μL,5×GC Buffer 5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2 μL,Forward primer（10 μmol/L）1 μL,Reverse primer（10 μmol/L）1 μL,DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。

擴增條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（30 次循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min。隨后擴增子送上海派森諾生物技術有限公司的Illumina MiSeq 平臺（Illumina,San Diego,CA,USA）上進行測序[32?35]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）軟件，剔除疑問序列以及統(tǒng)計數(shù)，對所獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU 劃分，刪除豐度值小于0.001%的OTU，采用Silva 數(shù)據(jù)庫（Release132，http://www.arb-silva.de）[20]對OTU 進行分類鑒定。然后利用R 軟件繪制帶有各種分類信息的柱狀圖，直觀比較不同樣本OTU 數(shù)量和分類狀態(tài)識別結果的差異。使用SPSS 軟件（SPSS 軟件，中國上海）進行數(shù)據(jù)處理。使用ORIGIN（OriginLab）對曲線進行分析。

2 結果與分析

2.1 理化指標的動態(tài)分析

醋醅固態(tài)發(fā)酵周期是17 d，在整個發(fā)酵過程中理化指標的變化如圖3 所示，發(fā)酵初期溫度為27.4 ℃，結合理化指標中溫度前三天的變化，推測出由于好氧微生物的生長繁殖，導致物料內部的溫度迅速上升，在第3 d 時溫度迅速增長至38.2 ℃，此后溫度處于緩慢上升的趨勢，直至第9 d 溫度達到最高點44.4 ℃；之后隨著時間的延長，溫度處于緩慢下降的趨勢，這是由于好氧微生物的緩慢衰亡，厭氧微生物出現(xiàn)生長，因此溫度仍然處于37 ℃左右。

圖3 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中各理化指標的動態(tài)變化圖Fig.3 Dynamic changes of physicochemical indexes during the solid-state fermentation of Sichuan Sun vinegar

水分是保持微生物生長較重要的因素之一，發(fā)酵前三天由于微生物的生長消耗了大量的物料，產生的熱量使得物料內部的水分蒸發(fā)，因此水分含量急劇下降；隨著發(fā)酵的進行，微生物代謝產生的氣體使得物料內部的水分含量有所增加，使得水分含量出現(xiàn)增加。整個發(fā)酵過程中，水分含量保持在49.2%～58.3%之間波動。

由于發(fā)酵過程中酸物質的積累（發(fā)酵前7 d 酸度一直處于上升的趨勢），使得發(fā)酵pH 在第1～7 d 急劇下降，之后趨于平緩（基本維持在pH3.9 左右）直到發(fā)酵結束；酸度在第7～11 d 略有小幅下降，推測是在這個階段，物料中的酸性物質被微生物繼續(xù)利用，使得酸物質減少。

發(fā)酵第1～3 d，還原糖含量急劇上升，到第5 d急劇下降，然后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，這可能是由于曬醋的發(fā)酵過程與糖化、酒化、醋化同時進行，糖化主要處于整個醋酸發(fā)酵的初始階段，在第3 d 后，在還原糖充足的情況下，微生物開始大量利用還原糖進行發(fā)酵。在整個發(fā)酵過程中，氨基酸氮的含量始終呈上升趨勢，這與發(fā)酵液中產生蛋白酶的微生物密切相關，而蛋白質在蛋白酶作用后產生氨基酸等含氮物質。

2.2 醋醅發(fā)酵過程中乙酸、乳酸和乙醇的變化情況

從圖4 分析可知，發(fā)酵的前7 d，乳酸和乙酸的含量都在明顯升高，這一現(xiàn)象也與圖3 中酸度升高，pH 下降的變化相吻合。同時，乳酸的含量要高于乙酸，說明發(fā)酵前期乳酸發(fā)酵占主導地位，使得乳酸含量較高；到第11 d 時乳酸被微生物利用使得含量下降。在第9 d 時乙醇含量達到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢，表明乙醇開始大量被轉化為乙酸，發(fā)酵開始逐漸步入以醋酸發(fā)酵為主的發(fā)酵階段，此時乙酸含量又出現(xiàn)上升。由于曬醋的發(fā)酵過程同時包含糖化、酒化和醋化，因此當發(fā)酵結束時（第17 d）乙酸含量（16475.10±670.31）mg/100 g 和乳酸（14895.64±717.30）mg/100 g 含量出現(xiàn)了相差不大的情況。

圖4 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中乙酸、乳酸和乙醇含量的動態(tài)變化圖Fig.4 Dynamic changes of acetic acid,lactic acid and ethanol contents during the solid-state fermentation of Sichuan Sun vinegar

2.3 高通量測序結果分析

2.3.1 DNA的提取和擴增 醋醅樣本的DNA 擴增后電泳圖如圖5 所示，9 個樣品的9 條序列均有明顯的條帶出現(xiàn)，說明DNA 擴增成功，可以進入測序平臺進行測序。

圖5 DNA的擴增電泳圖Fig.5 Amplification electrophoresis image of DNA

2.3.2 醋醅微生物群落測序深度評價及測序分析稀釋曲線（Rarefaction curve）主要利用各醋醅在不同測序深度時的微生物Alpha 多樣性指數(shù)構建曲線，以此反映各醋醅在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。它可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同額醋醅中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可以用來說明醋醅的測序數(shù)據(jù)量是否合理。如圖6 所示，隨著測序深度的增加，OTU 數(shù)量呈上升趨勢，直至趨于平緩。但第13 d的稀釋曲線并沒有接近飽和，說明如果測序深度繼續(xù)增加，可以發(fā)現(xiàn)新的OTU，但上升范圍逐漸穩(wěn)定，從測序量可以看出本次測序已滿足所需要的測序深度，測序量基本合理。

圖6 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中細菌稀釋曲線Fig.6 Bacterial rarefaction curve during the solidstatefermentation of Sichuan Sun vinegar

從表1 可以看出，本次測序共獲得344233 條序列，序列的平均長度為394 bp，能夠覆蓋16S rDNA V3～V4 區(qū)域；在發(fā)酵的過程中結合五個分界來看，細菌的OTU 在發(fā)酵初期（1～3 d）略微減少，這可能是一些細菌進入發(fā)酵狀態(tài)還沒有適應環(huán)境，表現(xiàn)出下降的趨勢。第3～7 d 細菌OTU 開始上升，達到高峰，第7～11 d 發(fā)酵過程中細菌OTU 總量略微下降，但差異較小。第11～15 d 細菌OTU 數(shù)量明顯減少，這也證實了因酸度上升導致微生物減少的結果。

表1 不同發(fā)酵時間樣品的測序量以及測序分類地位劃分Table 1 Sequencing quantity of samples with different fermentation time and classification of sequencing status

2.3.3 醋醅發(fā)酵過程中微生物群落的α-多樣性分析對于微生物群落來說，有多種指標可以反映其多樣性，其中多樣性指數(shù)包括Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)等。Chao 1 或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon 指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，且主要針對優(yōu)勢菌群；Simpson 指數(shù)對均勻度和群落中的優(yōu)勢OTU 更敏感；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。

從表2 可以看出，在整個發(fā)酵的17 d 中，Chao 1 指數(shù)在651.38～1119 之間波動變化，發(fā)酵的初始階段，來自于醋曲和原料中的微生物不能較好的適應發(fā)酵環(huán)境，使得微生物生長出現(xiàn)了一個短暫的停滯，使得豐富度下降，因此P3的豐富度小于P1 豐富度；當微生物適應環(huán)境后，出現(xiàn)迅速的增長，因此從第3～7 d，樣本豐富度上升并達到最大值1119，之后豐富度趨于平穩(wěn)；在發(fā)酵的后期，由于酸物質的累積，環(huán)境中pH 下降，使得微生物生長受到抑制甚至是衰亡，導致第15～17 d 樣本的豐富度顯著下降。Shannon 指數(shù)在4.59～6.74 之間波動，出現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢，與Chao 1 指數(shù)不同之處在于發(fā)酵第3 d的多樣性要高于第1 d，說明發(fā)酵初期，由原料、環(huán)境中帶入了微生物，使得多樣性出現(xiàn)了增加。在第7～9 d，由于乙酸和乙醇含量在繼續(xù)上升（圖4所示），使得環(huán)境中的微生物生長受到影響，進而微生物群落的多樣性和豐富度也有所下降。Simpson 指數(shù)在整個發(fā)酵過程中沒有出現(xiàn)大幅變化，說明微生物群落中優(yōu)勢菌群的均勻度沒有太大變化。

表2 基于擴增子測序的微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity index based on amplicon sequencing

2.3.4 分類學組成分析 由圖7 可知，在整個發(fā)酵過程中，第15 d 發(fā)酵的細菌各分類水平歸屬于11 個門、14 個綱、36 個目、45 個科、79 個屬，為所有樣本中最高的，而第3 d 樣本的細菌各分類水平類群數(shù)則為最低的。

圖7 各分類水平的微生物類群數(shù)統(tǒng)計圖Fig.7 Statistical diagram of microorganism groups at different taxonomic levels

在發(fā)酵第1～3 d的微生物類群處于下降階段，第3～7 d 微生物類群處于上升，第7～9 d 處于下降，然后第9～15 d 又繼續(xù)上升，第15～17 d 微生物類群又開始下降。結合前面理化指標、酸變化趨勢，推測產生這種結果的原因如下：a.第1 d的醋醅中含有來自于醋曲和原料帶入的微生物，使得微生物類群有較高的水平，隨著發(fā)酵的進行，當中的部分微生物生長受到環(huán)境因素的改變，出現(xiàn)了短期的延滯，因此第3 d 微生物類群水平下降；b.隨著微生物適應了發(fā)酵環(huán)境，微生物的生長處于快速增長時期，從第3～7 d，微生物類群又出現(xiàn)了增加的趨勢；c.在發(fā)酵的第7～9 d，隨著發(fā)酵環(huán)境中的乙酸、乳酸含量升高，微生物類群出現(xiàn)小幅下降的變化；d.隨著第9～15 d 乙醇含量的降低，乙酸含量的增加，有利于酸性微生物的生長，因此微生物類群又開始上升；e.第15～17 d 微生物類群緩慢下降，有可能是進入后期，隨著營養(yǎng)物質的消耗，酸性物質的累積，促使微生物類群減少。

由圖8 可知，在整個發(fā)酵過程中，厚壁菌門（Firmicutes）在發(fā)酵前期占主導，相對豐度為53.1%，為發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌群，隨著時間的延長，呈逐漸下降的趨勢；變形菌門（Proteobacteria）在發(fā)酵后期占主導，相對豐度為44.1%，為發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌群，并隨時間的延長而逐漸增加。

圖8 微生物門水平上組成和豐度分布Fig.8 Microbial composition and abundance distribution

由圖9 可知，發(fā)酵的第1 d，主要微生物群落為乳桿菌屬（Lactobacillus），魏斯氏菌屬（Weissella）和頂生雀麥菌屬（Bromus_tecrorum）分別占36.8%、32.7%和14.5%，當中的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）主要來源于醋曲，頂生雀麥菌屬可能來源于發(fā)酵原料及周邊環(huán)境；由豐度顯示，在發(fā)酵第1 d 后頂生雀麥菌屬（Bromus_tecrorum）逐漸下降到零，可推測該菌屬并非是曬醋發(fā)酵過程中的主導菌屬。

圖9 微生物屬水平上組成和豐度分布Fig.9 Microbial composition and abundance distribution

發(fā)酵第1～3 d，乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度上升至峰值，占比高達91.5%，其次還有少量的魏斯氏菌屬（Weissella），占4.1%；發(fā)酵第3～7 d，雖然乳桿菌屬（Lactobacillus）仍是主導菌屬，但豐度有所下降。與此同時，醋桿菌屬（Acetobacter）出現(xiàn)增長的趨勢；發(fā)酵第7～9 d，乳桿菌屬（Lactobacillus）逐漸增加，使得發(fā)酵過程中酸物質的積累；發(fā)酵第9～17 d 乳酸菌屬（Lactobacillus）呈逐漸下降的趨勢，最終相對豐度占2.3%。醋桿菌屬（Acetobacter）呈上升的趨勢，最終相對豐度占66.5%。由于前3 d 屬于發(fā)酵前期，溫度尚未達到發(fā)酵溫度，且沒有進行翻醅，氧氣的供給量相對較少，故乳桿菌屬呈現(xiàn)大量生長的勢頭；而醋桿菌屬因氧氣供應不足導致生長緩慢；隨著醋醅發(fā)酵溫度上升，為了保證發(fā)酵的正常進行需進行翻醅降溫，此時供氧量增大，促使醋酸桿菌大量生長，而部分厭氧菌則因此衰亡，最終醋桿菌屬成為主導菌屬。

除此之外，在曬醋微生物群落分類中還發(fā)現(xiàn)了少量的貪銅菌屬（Cupriavidus）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），相對豐度分別占11.8%、8.0%和3.7%。在第13 d、第15 d 和第17 d，這三類菌的占比總和相對豐度分別為46.9%、60.6%和23.5%。

2.3.5 聚類分析 系統(tǒng)聚類法的基本思路是將多個樣品各自作為一類，然后計算各類之間距離的遠近，首先將距離最近的兩類合并成新的一類，然后用所得到的新一類和其他類樣品再進行距離分析，將此時距離最近的再歸為一類，直至將所有樣品合為一大類，最終形成聚類樹狀圖[21?22]將測序結果通過非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進行計算，以等級樹的形式展示樣本間的相似度，如圖10 所示。

圖10 基于Weighted UniFrac 距離矩陣的UPGMA 聚類分析圖Fig.10 UPGMA cluster analysis diagram based on Weighted Unifrac distance matrix

從圖10 可以發(fā)現(xiàn)，整個發(fā)酵過程中的17 個樣品中，第15～17 d 和第13 d 可以優(yōu)先聚為一類，提示其菌落群落特征最大程度區(qū)別于其他幾個類別的樣品，這與前面分類學水平分析的結果相一致；其次是第5～11 d 可以聚為一類，其中第7～9 d 與第11 d 又繼續(xù)聚為一類，這與前面的研究結果也相對應；最后是第1～3 d 聚為一類。這提示了曬醋發(fā)酵過程中菌落群落的差異，反映了各樣品之間的親緣關系強弱，為進一步揭示曬醋的發(fā)酵代謝機理奠定了基礎。

3 結論

本研究采用高通量測序分析四川曬醋固態(tài)發(fā)酵階段細菌群落變化情況，通過醋醅動態(tài)理化指標、細菌群落的分類學組成的變化和聚類分析表明，乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）為發(fā)酵過程的主要優(yōu)勢菌屬，并初步劃分了“三邊同池”的時間節(jié)點，推測出發(fā)酵第1～3 d 是發(fā)酵前期；發(fā)酵第5～11 d 是發(fā)酵中期；發(fā)酵第13～17 d 是發(fā)酵后期。

此外，通過研究發(fā)現(xiàn)曬醋發(fā)酵后期除了醋桿菌屬（Acetobacter）為優(yōu)勢菌屬外，還有其他優(yōu)勢菌屬，為貪銅菌屬（Cupriavidus）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），這些菌屬在其他食醋中的相關報道較少，這表明微生物多樣性與發(fā)酵原料、發(fā)酵工藝、地理位置、發(fā)酵環(huán)境有很大的關系。

本研究的發(fā)現(xiàn)為食醋功能成分與微生物菌群的聯(lián)系奠定了基礎，對進一步了解四川曬醋釀造和提高食醋的品質與安全具有重要意義。