商業發酵劑中乳酸乳球菌發酵風味特性及其化學表征的研究

謝 翔，公丕民，劉 奧，張鴻偉，仝令君，易華西，王亞威，劉同杰,，張蘭威,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000；2.青島海關技術中心，山東青島 266000；3.北京多愛特生物科技有限公司，北京 100000）

目前國內以酸奶為代表的發酵乳風味等品質同質化現象比較嚴重，已經與營養和品質、個性化需求不斷增長形成矛盾[1]。發酵乳是一種經乳酸菌等微生物發酵的乳制品，從特色發酵菌種方面改善發酵乳品質，是改善產品同質化、提升產品特色的重要途徑。風味是發酵乳重要的品質特性，雖然常用發酵劑中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌能產生發酵乳中關鍵的風味物質，但這些風味物質的產量遠遠不夠，目前市面上多采用添加食用香精和其他輔料來滿足消費者對不同風味的需求。然而，香精等的風味與天然牛奶發酵香氣之間還存在一定的差 距[2]。因此，利用發酵過程本身，通過其他乳酸菌和傳統發酵劑結合，生產出風味獨特的發酵乳是發酵乳生產的新趨勢[3]。已有一些研究揭示了發酵乳中代謝物的形成以及不同乳酸菌對風味化合物的影響[4?5]，其中含有四個碳原子的化合物是酸奶的典型香氣來源，統稱為C4 化合物，包括2,3-丁二酮（雙乙酰）、乙偶姻和2，3-丁二醇等[6]。在風味方面，與同型發酵的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌相比，乳酸乳球菌雙乙酰變種在代謝糖產生乳酸的同時會產生更多的風味物質[7]。與嗜熱鏈球菌相比，乳酸乳球菌會產生更高含量的2,3-丁二酮和乙偶姻，這兩種成分對奶香味有較大貢獻，可以改善發酵乳的風味。此外，乳酸乳球菌會產生更多的3-甲基-1-丁醇，與發酵乳中的果香味相關[8]。

乳酸乳球菌憑借其水解蛋白和產生揮發性風味物質的能力，在改善發酵乳制品質地和風味方面發揮巨大作用，廣泛應用于干酪、酸奶和酸奶油等乳制品生產[9]。乳酸乳球菌包含4 個亞種，分別是乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）、乳酸乳球菌霍氏亞種（Lactococcus lactissubsp.hordniae）和Lactococcus lactissubsp.tructae[10]。乳酸乳球菌乳酸亞種的一個變種是乳酸乳球菌雙乙酰變種（Lactococcus lactissubsp.lactisvar.diacetylactis）。乳酸乳球菌能夠賦予發酵乳制品良好的質地和風味，具有極高的工業和經濟價值。在發酵乳制品生產過程中，乳酸乳球菌雙乙酰變種能利用檸檬酸代謝生成2,3-丁二酮、二氧化碳和其他物質,賦予發酵乳制品特殊的風味[11]。在奶酪的生產過程中一般包括較長的成熟期，在此期間，牛奶成分會在乳酸乳球菌的作用下轉化為決定奶酪口味的各種風味化合物。乳酸乳球菌通過降解乳蛋白以及代謝氨基酸產生揮發性香氣成分，在奶酪風味形成中起著核心作用，并且在乳酸乳球菌中已廣泛研究了涉及的蛋白質及其表達調控[12]。此外，發酵乳制品的質地特性不僅取決于發酵酸化引起的乳蛋白物理化學特性的變化，還受乳球菌產生的胞外多糖的影響，這些多糖有助于改變發酵乳制品的流變特性[13]。雖然乳酸乳球菌對發酵乳制品有重要的貢獻，然而，目前針對乳酸乳球菌不同菌株風味發酵特性、不同風味香型區分的研究較缺乏，阻礙了乳酸乳球菌的精準和高效應用。

GC-IMS 法是近些年出現的風味分析的新技術，與傳統的頂空-氣相色譜質譜、固相微萃取-氣相色譜質譜等方法相比，具有靈敏度高、檢測限低、適合痕量組分分析、樣品無需前處理、操作方便、檢測速度快等優點[14?15]，且應用GC-IMS 法得到的數據包括保留時間和漂移時間，是二維的分離，進一步提高了定性分析的準確性。目前GC-IMS 技術在乳制品方面的應用研究較少，尤其是在酸奶風味研究方面。與其他風味分析儀器所不同的是：氣相色譜-質譜聯用技術用于分析風味化合物的組成，電子鼻用于區分不同乳制品的風味，而GC-IMS 在獲得風味化合物組成的同時能區分不同的樣品[16]。本研究以各國商業發酵乳發酵劑中分離的乳酸乳球菌為實驗對象，研究其在發酵乳中的風味特征，并基于感官評價和風味物質分析，確定其香型和關鍵風味物質，以期最終應用于特色風味發酵乳的生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵劑2-1、2-2、2-3、6-17、6-18 美國杜邦Danisco 公司；發酵劑2-9 丹麥CHR-HANSEN 公司；發酵劑2-13 荷蘭DSM 公司；發酵劑9-17 北京多愛特生物科技有限公司；HB0390 M17 瓊脂、HB0391 M17 肉湯、HB8800 牛奶培養基、HB0384-1 MRS 肉湯、HB0384 MRS 瓊脂 青島高科園海博生物技術有限公司；全脂乳粉 黑龍江飛鶴乳業有限公司；氯化鈉、一水檸檬酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside,XGal） 上海索萊寶生物科技有限公司；牛奶香精315616 江蘇豪蓓特食品有限公司；Kerry chedda cheese flavour c82142-02、Creamcheese 050004 1383T 芬美意香料（中國）有限公司。

iCinac 1710109 乳品發酵酸化監控儀 法國AMS 公司；SW-CJ-1D 型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；FlavourSpec?氣相色譜-離子遷移譜聯用儀 德國G.A.S mbH 公司；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；LRH-150F 生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；HLR-310F 實驗室冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司；Multiskan FC 酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；FA2204B 電子天平（d：0.1 mg） 上海天美天平儀器有限公司；YP1002N 電子天平（d：0.01 g） 上海菁海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸乳球菌的分離、鑒定

1.2.1.1 乳酸乳球菌的分離 將收集到的發酵劑用12 g/100 mL 已滅菌的牛奶培養基溶解，然后取1 mL溶解液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布于MRS 固體平板上，在30 ℃培養48 h。挑選不同菌落分別進行平板劃線至純菌，顯微鏡觀察細菌形態，挑取在顯微鏡下形態為球菌的接種到MRS 液體培養基，之后通過生理生化鑒定[17?18]。

1.2.1.2β-半乳糖苷酶活性測試 在滅菌后的MRS 固體培養基中加入0.06 g/L的X-Gal，混勻后倒入培養皿中，將分離菌株在培養皿上劃線，30 ℃培養2 d，觀察菌落顏色。

1.2.1.3 耐鹽性實驗 將在X-Gal 培養基上顯白色的菌株以2%（v/v）比例接種到含4 g/100 mL NaCl的MRS 液體培養基中，30 ℃培養2 d，觀察能否生長。

1.2.1.4 利用檸檬酸產氣實驗 將在X-Gal 培養基上顯白色的菌株以2%（v/v）比例接種到含0.5%（w/v）一水檸檬酸的M17 液體培養基中，30 ℃培養2 d，觀察杜氏小管中產氣情況。

1.2.1.5 乳酸乳球菌的鑒定 對分離得到的可能為乳酸乳球菌的菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA 鑒定，將序列在NCBI 網站上進行Blast 比對，選取其中的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）進行后續實驗。

1.2.2 乳酸乳球菌生長的測定 將活化好的菌株以2%（v/v）的接種量，接種到裝有10 mL 滅菌后的M17 肉湯培養基的試管中，渦旋混勻后取200 μL 加入到無菌96 孔板中，于30 ℃恒溫培養箱中培養，間隔2 h 用多功能酶標儀測定OD600nm值，連續測定14 h，每株菌4 個平行，以未接菌M17 培養基為空白。并以生長時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制菌株生長曲線[19]。

1.2.3 菌株發酵乳的制備及pH 測定 全脂乳粉以12 g/100 mL的比例溶于50 ℃的蒸餾水中復原，充分溶解之后進行殺菌（95 ℃，10 min）[20]，立即冷卻至30 ℃后，按2%（v/v）比例接種菌株，30 ℃發酵至pH4.50±0.05 后終止發酵，置于4 ℃后熟44 h，發酵過程中采用iCinac 乳品發酵酸化監控儀對菌株發酵過程中pH 變化和pH 變化率（d pH/d t）進行監測。采集發酵終止樣本于4 ℃貯藏備檢。

1.2.4 感官評價 7 名接受感官評價培訓的成員（6 名女性和1 名男性）對發酵樣品進行感官評價。所有的小組成員都熟悉相關風味特征，且要求確定每個發酵乳樣品中最突出的香型。取樣品10 g 預先密封在50 mL 品嘗杯中，室溫保存30 min，以使風味成分在頂空平衡[21]，感官評價小組成員對于每個樣品選出最接近的香型，記為1 分。參比樣品的配制由乳酸乳球菌發酵乳加入一定比例香精制得，具體比例如表 1 所示。

表1 參比香型所加入香精比例Table 1 Reference fragrance composition

1.2.5 GC-IMS 測定揮發性風味成分

1.2.5.1 樣品準備 準確稱取2.0 g 在1.2.3 中制備的發酵乳制品于頂空瓶中，每個樣品3 個平行。

1.2.5.2 頂空條件 孵育溫度為60 ℃，孵育時間10 min，孵育速度250 r/min；進樣速率51 mL/min，進樣針溫度T3 為65 ℃[22]，進樣體積500 μL。

1.2.5.3 GC-IMS 條件 色譜柱為FS-SE-54-CB-1 色譜柱（15 m × 0.53 mm,1 μm）；IMS 溫度T1 為45 ℃[23]；柱溫T2 為40 ℃[24]；漂移氣（E1）和載氣（E2）均為氮氣，純度為99.999%。色譜洗脫程序：0～20 min 時，E1 恒定為150 mL/min；0～2 min 時，E2的流量為2 mL/min；2～5 min 時，E2的流量由2 mL/min 增大至10 mL/min；5～10 min 時，E2的流量由10 mL/min 增大至50 mL/min；10～20 min 時，E2的流量由50 mL/min 增大至100 mL/min[25]。

1.3 數據處理

所有數據均表示為平均值±標準差的形式。利用工作站Laboratory analytical viewer（LAV）對得到的譜圖上的峰進行積分，用GC × IMS library search 參照NIST 數據庫和IMS 數據庫對物質進行定性分析，之后生成指紋圖譜；并用The Unscrambler X 10.4 對譜圖上峰的峰強度進行主成分分析（PCA）[26]；以揮發性風味物質的峰強度為X 變量，感官評價的得分為Y 變量，用Simca 14.1 進行偏最小二乘回歸分析（PLSR）分析并計算變量投影重要性（VIP）值。

2 結果與分析

2.1 乳酸乳球菌分離鑒定與生長特性

2.1.1 菌株分離與鑒定 X-Gal 是β-半乳糖苷酶的顯色底物，在后者催化下會產生藍色底物。因乳酸乳球菌不能表達β-半乳糖苷酶，不能水解X-Gal，故菌落為白色，發酵劑中的其他菌因可以水解X-Gal，菌落為藍色[27]。

對分離得到的菌株進行革蘭氏染色后，在油鏡下觀察，觀察發現：乳酸乳球菌呈紫色，為革蘭氏陽性菌株；在油鏡下菌體細胞呈圓形或卵圓形，沿長軸方向成鏈；大多數成對或短鏈，有些形成長鏈[17]，符合伯杰細菌鑒定手冊上對于乳酸乳球菌的描述，初步判定分離得到的菌株為乳酸乳球菌。

經過β-半乳糖苷酶活性測試、耐鹽性、利用檸檬酸產氣實驗得到可能為乳酸乳球菌的菌株，后續進行16S rRNA 測序，將測序結果在NCBI 網站上Blast 顯示均為乳酸乳球菌，結果如表 2 所示。根據生理生化表現及發酵劑產品信息判定：菌株2-2-1、6-17-b2、6-18-b2、9-17-b12 是乳酸乳球菌雙乙酰變種，菌株2-1-2、2-2-b2、2-2-b12、2-3-a2、2-9-7、2-9-a2、9-17-b3、9-17-b4 是乳酸乳球菌乳酸亞種，菌株2-2-3、2-2-b1、2-2-b4、2-3-a1、2-9-1、2-9-4、2-13-1、2-13-a1、9-17-b11 是乳酸乳球菌乳脂亞種。

表2 乳酸乳球菌的生理生化及其16S rRNA 測序結果Table 2 Physiological and biochemical and 16S rRNA sequencing results of Lactococcus lactis

2.1.2 菌株生長與產酸特性 根據菌株的生長曲線（圖 1），在0～2 h，菌株處于生長遲滯期；在2～4 h，處于生長遲滯期和對數期的過渡階段，繁殖量增長較遲緩期稍大；4～6 h，所有菌株都處于對數期，此時期菌株繁殖較快；在6 h 時，大部分菌株生長都達到穩定期，部分菌株如2-2-b1、2-2-b2、2-2-b12、6-18-b2 對數期持續到8 h，此時進入穩定期，菌株2-3-a1、2-3-a2、6-17-b2、9-17-b12 在10 h 時進入穩定期。

圖1 菌株在M17 培養基中30 ℃培養生長曲線Fig.1 Growth curve of strains cultured in M17 medium at 30 ℃

從圖 2 可知，在pH4.8～5.6 之間時，多數菌株在此階段產酸最快。產酸速率整體上呈先增長后下降的趨勢，大多數菌株在發酵300～500 min 之間產酸最快，但不同菌株間的產酸速率存在明顯的區別，到達發酵終點（pH4.5）的時間在470～800 min不等。

圖2 菌株在脫脂乳中pH 變化曲線Fig.2 The pH change curve of the strain in skimmed milk

2.2 發酵乳風味特征的感官評價

如表 3 所示，根據感官評價結果，對單菌株發酵乳進行風味分型，奶香味突出的菌株有12 株，分別為：6-18-b2、2-13-a1、2-13-1、2-9-a2、2-9-1、2-3-a1、9-17-b11、9-17-b4、2-2-3、2-2-b1、2-1-2、2-2-b2；以酪香味為特色的菌株有2 株：9-17-b12、6-17-b2；奶油味的菌株有3 株：2-2-1、2-9-4、2-3-a2。其余4 株菌的發酵乳香型同時具有以上香型中的兩種，并無突出香型，難以區分。

表3 菌株風味感官分型結果Table 3 Flavor sensory typing results of strains

2.3 發酵乳GC-IMS 檢測揮發性成分分析

對單菌株發酵乳做GC-IMS 檢測，譜圖中共分離出38 個峰，定性后共有25 種已知成分，7 個同時存在單體和二聚體，6 種未知成分；其中25 種已知成分中，有醇類9 種、酮類8 種、醛類3 種、羧酸1 種、酯4 種。各成分按保留指數排序得表 4。

表4 發酵乳中定性出的成分Table 4 Components in fermented milk

續表 4

賦予酸奶良好風味的主要化合物是2,3-丁二酮、乙偶姻和2-丁酮[28?29]。大多數醇類化合物的風味閾值較高，因此認為醇類化合物對發酵乳的風味影響不大[30]。醛類化合物的閾值較低，對發酵乳風味的形成貢獻較大。大多數的酯類化合物的閾值較低，具有果香味或堅果仁味[31]。酮類對發酵乳風味的構成具有重要意義：2,3-丁二酮可以賦予發酵乳濃郁的奶油香味[32]，乙偶姻是許多乳制品中常見的風味物質，能賦予發酵乳弱奶油香味[28]，它們的閾值很低，微量的2,3-丁二酮和乙偶姻也會對發酵乳的風味產生影響[33]。此外，2-丁酮、2-戊酮、2-庚酮分別呈果香味、甜香味和奶油味[15]。

2.4 特異性指紋圖譜

GC-IMS 具有較高的檢測靈敏度，基于此可對不同菌株的風味物質進行指紋特征分析，并可輔助用于菌株的判定。將上述38 個峰積分后，用LAV的Gallery Plot 插件生成指紋圖譜（圖 3）。指紋圖譜中可以看出：菌株6-18-b2、6-17-b2、9-17-b12、2-2-1的發酵乳中存在揮發性成分2,3-丁二酮和乙偶姻，而其他菌株發酵乳沒檢出這兩種成分，結合發酵劑說明書及前期生理生化表現，基本可以確定上述四個菌株為乳酸乳球菌雙乙酰變種（Lactococcus lactissubsp.lactisvar.diacetylactis）[7]。

圖3 菌株發酵乳揮發性成分的指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of volatile components of fermented milk of strains

同時，發現菌株2-1-2、2-2-1、2-2-3、2-2-b1、2-2-b2、2-2-b4 發酵乳中乙酸乙酯含量高于其他菌株發酵乳，菌株2-3-a2 發酵乳中測得2,3-戊二酮含量較高，在其他菌株發酵劑中較少或幾乎不存在，2,3-戊二酮具有奶油、焦糖香氣，并帶有堅果底香，而低含量的乙酸乙酯具有清靈、微帶果香的酒香[25]。在所有發酵乳樣品中均存在的揮發性風味成分有：異丙醇、正丙醇、2-丁酮、乙酸乙酯、2-戊酮、戊醛、1-戊醇、正己醛、2,3-丁二醇、正己醇、2-庚酮，這些成分在之前的發酵乳相關研究中已被檢測出[15,34?36]，可能是發酵乳中較為基本的成分。正己醛呈青草味，1-戊醇呈辣味，并伴有酒味[15]，2,3-丁二醇是乙偶姻的還原形式，對奶油或黃油味的貢獻有限[3]。

2.5 主成分分析

用LAV的Simca PCA 插件和計量分析軟件The Unscrambler X 10.4 對21 株菌的揮發性成分進行主成分分析。用Min-Max 法對原始數據進行標準化，將峰強度數值映射到0～1000 之間。結果發現：前兩個主成分解釋69%的差異，前四個主成分解釋了82%的差異。從圖 4 中可以看出：在主成分1 方向上，菌株6-18-b2、6-17-b2、9-17-b12、2-2-1 和其他菌株可以明顯區分；在主成分2 方向上，這四株菌可分為三類：菌株6-18-b2 為一類，菌株6-17-b2 和9-17-b12 為第二類，菌株2-2-1 為第三類，分類情況與感官評價結果表現一致。

圖4 二十一株菌發酵乳PCA 圖Fig.4 Principal component analysis diagram of fermented milk

通過比對PCA 圖和載荷圖（圖 5），可以得出：主成分1 與乙偶姻、3-甲基-1-丁醇、丁酸甲酯、2,3-丁二酮、2-甲基丙酸乙酯、2,3-戊二酮、正丁醇、正丁醛、2-甲基丙醇、丁酸乙酯、羥丙酮、2,3-丁二醇、芳樟醇、戊醛、乙酸乙酯、2-戊酮、異丙醇呈正相關，與1-戊醇、正己醛、正己醇、正丙醇、丁基甲基酮、2-丁酮呈負相關。主成分2 與2-戊酮、正己醇、2-庚酮、芳樟醇、2-甲基丙醇、戊醛、2,3-戊二酮、3-甲基-1-丁醇、2,3-丁二酮、1-戊醇、乙偶姻、2,3-丁二醇、正己醛、丁酸甲酯、正丁醇呈負相關，與乙酸乙酯、羥丙酮、正丁醛、丁酸、異丙醇、2-丁酮、正丙醇、丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁基甲基酮呈正相關。

圖5 載荷圖Fig.5 Loading diagram

對菌株6-18-b2、6-17-b2、9-17-b12、2-2-1 進一步做PCA 分析如圖 6 所示。因為這四株菌均為乳酸乳球菌雙乙酰變種，所以此類菌株發酵產生的標志性成分2,3-丁二酮和雙乙酰在上述四株菌的發酵乳中均有檢測到，這是他們的共同點。此外，結合圖 7載荷圖，可以得出：以菌株2-2-1 為代表的奶油味，乙酸乙酯、丁酸對此香型貢獻較大；以6-18-b2 為代表的奶香味，2-戊酮、戊醛、2,3-戊二酮、3-甲基-1-丁醇對此香型貢獻較大；以6-17-b2 和9-17-b12 為代表的酪香味，正己醛、正己醇、2-丁酮對此香型貢獻較大。

圖6 四株菌發酵乳的PCA 圖Fig.6 Principal component analysis diagram of fermented milk of four strains

圖7 四株菌發酵乳載荷圖Fig.7 Loading diagram of four strains fermented milk

2.6 PLSR 分析感官香型與風味成分的關系

為了探究感官評價分型和揮發性風味物質的關系，以揮發性風味物質的峰強度為X 變量，感官評價的得分為Y 變量，對菌株6-18-b2、6-17-b2、9-17-b12、2-2-1 進行偏最小二乘回歸分析。結果如圖 8所示，可以看出：奶香味與戊醛、2-戊酮、2,3-戊二酮、2,3-丁二酮、乙偶姻、3-甲基-1-丁醇等物質聯系較大，已有研究中也發現2,3-丁二酮賦予發酵乳奶香味[37]；奶油味與乙酸乙酯和丁酸聯系較大；酪香味與正己醛、正己醇、1-戊醇聯系較大。乙酸乙酯可以帶來更多的果味和奶油味[38]。

圖8 感官分型與揮發性成分的PLSR 圖Fig.8 Sensory classification and partial least squares regression analysis diagram of volatile components

進一步根據VIP 值（Variable Importance in Projection）估計PLS 投影中每個變量的重要性，VIP>1的變量與解釋Y 變量最相關，因此，從圖 9 可以得出，據VIP 值對發酵乳的風味影響較大的風味成分有:乙酸乙酯、正己醛、正丁醛、正己醇、丁酸乙酯、2-甲基丙醇、丁酸甲酯、2-庚酮、2-丁酮。

圖9 風味物質的VIP 圖Fig.9 Variable importance in projection of flavor substances

綜合PLSR 結果和VIP 值來看，對酪香味影響比較大的成分有正己醛、正己醇；對奶油味影響較大的成分有乙酸乙酯；而各成分對于奶香味的影響都不是很重要，因此對奶香味影響較大的成分還需要進一步研究確定。

3 討論與結論

從8 種商業發酵劑中分離得到21 株乳酸乳球菌，單獨發酵復原乳的感官風味可以明顯劃分為奶香味、奶油味、酪香味三個香型。采用GC-IMS 檢測并經PLSR 對香味分型和揮發性成分的相關性進行分析，確定對酪香味影響比較大的揮發性風味成分有正己醛、正己醇；對奶油味影響較大的成分有乙酸乙酯；奶香味雖然與戊醛、2-戊酮、2,3-戊二酮、2,3-丁二酮、乙偶姻、3-甲基-1-丁醇等物質聯系較大，但是

關鍵性成分仍需進一步確認。本文的研究表明可以通過添加特定香型的乳酸乳球菌菌株輔助發酵，有目地改善發酵乳風味，解決發酵乳同質化現象。同時，在確定對各香型影響較大的揮發性風味成分后，錨定這些關鍵基因，并進行調控，預期可進一步提升乳制品風味品質。