羊肚菌多糖含片的研制及其體外抗氧化活性研究

王雪梅，龍葉峰，林勇濤，周楚升，孔泳欣，吳思英，周春暉

（1.廣東輕工職業技術學院食品與生物技術學院，廣東廣州 510030；2.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303）

羊肚菌（Morchella esculenta）別名羊蘑、羊肚菜、草笠竹，是世界上珍稀的食藥用真菌之一，其香味獨特、營養豐富，在我國主要分布在云南、四川、甘肅、陜西等地。多糖類組分是菌體中重要的生物活性物質，具有提高機體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、降血脂等功能[1]。

多糖常用提取方法有熱水浸提法、酶解法、微波萃取法和超聲波輔助提取法等[2?4]。酶解法常用纖維素酶、果膠酶和蛋白酶破壞細胞壁和細胞膜，減少提取時細胞結構的阻力[5]。超聲波破壞細胞壁的結構，加速多糖的溶出[6]。與熱水浸提法相比，酶解法和超聲輔助提取法提取羊肚菌多糖，提取得率更高。此外，酶解法作用條件溫和，耗能低[7]，超聲輔助提取法提取時間短、效率高[8]。使用纖維素酶和木瓜蛋白酶復合酶解可以提高多糖的溶出率和提取得率，將酶解與超聲輔助兩種提取方法結合起來進行二次提取，將更有利于提高羊肚菌多糖的提取得率。目前羊肚菌多以鮮食或加工成干制品為主，而將羊肚菌開發成功能性食品、保健食品等高附加值產品研究相對較少。付天宇[9]經羊肚菌深層發酵制備緩解體力疲勞、輔助降血脂的羊肚菌口服液；劉超[10]曾研究表明羊肚菌多糖的抗結腸癌的作用；田雨[11]制備了羊肚菌抗氧化肽。羊肚菌功效成分經提取后開發成新型功能性食品具有巨大的市場和發展前景。羊肚菌多糖含片，易于服用，便于攜帶，給工作節奏快、機體免疫力低下等人士提供一款體驗感好的便利產品，豐富了羊肚菌健康食品的品類。

本文主要采用超聲波輔助酶解法，以羊肚菌多糖的提取得率為指標，優化獲得羊肚菌多糖的高效提取工藝，進一步實驗得出羊肚菌多糖含片的最佳制備配方，以期為羊肚菌多糖功能性食品開發提供技術途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌子實體 購自云南省麗江市；纖維素酶（酶活力為10 萬 U/g） 和氏璧生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為10 萬 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；菠蘿蛋白酶（酶活力為10 萬 U/g） 鑫誠生物科技有限公司；磷酸、苯酚、三氯乙酸 天津市永大化學試劑有限公司；三氯化鐵 天津市百世化工有限公司；水楊酸、七水合硫酸亞鐵 廣州化學試劑廠；鐵氰化鉀 廣州市番禺區建興試劑廠；DPPH 試劑 上海金穗生物科技有限公司；30%過氧化氫 廣州市海珠化學試劑有限公司；山梨糖醇河南萬邦實業有限公司；乳糖、甘露醇 山東佰晨食品配料有限公司；硬脂酸鎂 湖州市菱湖新望化學有限公司；維生素C 粉末 谷知味生物科技有限公司；95%乙醇溶液 河南鑫河陽酒精有限公司。

pH-100 筆式酸度計 上海力辰邦西儀器科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋、101-3AB 型電熱鼓風干燥箱、FW177 型中草藥粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；JJ500A 型分析天平 福建艾杰爾進出口有限公司；JY96-IIN 型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SC-3614 型高容量低速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；RE-52A 型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；V-5100 型分光光度計上海元析儀器有限公司；Zp19 型旋轉壓片機 泰州市黎明制藥機械有限公司；SY-3D 型片劑四用測定儀 廣州市深華生物技術有限公司；BCD-331WDGQ型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊肚菌多糖的提取

1.2.1.1 羊肚菌預處理 將羊肚菌子實體置于60 ℃的干燥箱中干燥3 h，然后將子實體進行粉碎并過20 目篩，干粉置于干燥器中儲存備用。

1.2.1.2 羊肚菌多糖的提取 稱取羊肚菌干粉2.00 g，參考陳超等[12]的方法，分別添加質量比為2:1的纖維素酶和木瓜蛋白酶，加去離子水，攪拌均勻，調節pH，置于55 ℃恒溫水浴鍋中酶解，酶解后分別進行150 W 超聲處理，95 ℃滅酶，5000 r/min 離心15 min，上清液儲存備用；將離心后的沉淀用相同體積的去離子水溶解，二次提取，離心得上清液；合并兩次上清液，減壓濃縮[13]，醇沉12 h[14]后，離心取沉淀、溶解，得到粗多糖溶液。

1.2.1.3 粗多糖的純化 取粗多糖溶液，加入1%菠蘿蛋白酶，加入1%活性炭，置于50 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，6000 r/min 離心15 min，取上清液，即為羊肚菌多糖溶液。

1.2.1.4 羊肚菌多糖提取單因素實驗 選擇液料比、酶用量、酶解pH、超聲時間與酶解時間為影響因素，以多糖提取得率為指標設計單因素實驗，研究其對羊肚菌多糖提取得率的影響。設置單因素各因素的條件和范圍如下：固定酶用量為1.4%、酶解pH 為5.5、超聲時間15 min、酶解時間1.5 h，液料比分別為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g；固定液料比為15:1 mL/g、酶用量為1.4%、酶解pH 為5.5、超聲時間15 min，酶解時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；固定液料比為15:1 mL/g、酶用量為1.4%、超聲時間15 min、酶解時間1.5 h，酶解pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；固定液料比為15:1 mL/g、酶解pH 為5.5、超聲時間15 min、酶解時間1.5 h，酶用量分別為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；固定液料比為15:1 mL/g、酶用量為1.4%、酶解pH 為5.5、酶解時間1.5 h，超聲時間分別為10、15、20、25、30 min。

1.2.1.5 響應面優化羊肚菌多糖提取工藝 根據單因素實驗的結果挑選出影響羊肚菌多糖提取得率的顯著因素，分別為液料比、酶解pH、超聲提取時間，以這三個因素為響應面優化因素，以羊肚菌多糖的提取得率為響應值，采用Design-Expert 8.05 軟件設計響應面試驗[15]響應面的因素和水平見表1。

表1 羊肚菌多糖提取工藝響應面優化試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels table of optimization experiment of Morchella esculenta polysaccharide extraction process by response surface methodology

1.2.2 羊肚菌多糖提取得率的測定

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 準確配制0.004、0.008、0.012、0.016、0.020、0.024、0.028 mg/mL的葡萄糖溶液，分別移取2 mL 不同濃度的葡萄糖溶液至試管中，并加入現配的6%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，靜置30 min，每組實驗設置三個平行，以空白組為參比溶液，490 nm 測吸光度，繪制標準曲線，得出回歸方程。

1.2.2.2 換算因子的測定 準確配制0.01 mg/mL的羊肚菌精多糖溶液，按照1.2.2.1 方法測量，得到結果根據回歸方程計算出精多糖溶液中葡萄糖的含量，并根據以下公式計算換算因子f。

式中，C 表示精多糖中葡萄糖的濃度，mg/mL；D 表示溶液的稀釋倍數；m 表示精多糖的質量，g。

1.2.2.3 多糖提取得率的測定 結合苯酚-硫酸法[16]測定多糖提取得率：將提取得到的羊肚菌多糖溶液定容到50 mL的容量瓶中、準確吸取2 mL 并定容到100 mL的容量瓶中，按照1.2.2.1 方法測量，并根據以下公式計算多糖提取得率。

式中，C 表示多糖溶液中葡萄糖的濃度，mg/mL；D 表示溶液的稀釋倍數；V 表示定容的體積，mL；f 表示換算因子；m 表示羊肚菌粉末質量，g。

1.2.3 羊肚菌多糖含片的制備

1.2.3.1 羊肚菌多糖含片的制備 參考劉梁等[17]的方法并加以改良，將最優提取條件下獲得的羊肚菌多糖溶液濃縮成浸膏，后加入填充劑和維生素C 混合，過14 目篩網制粒，置于60 ℃烘箱中干燥3 h，過20 目篩網整粒，加入硬脂酸鎂總混，旋轉壓片機壓片，即得羊肚菌多糖含片。

1.2.3.2 含片制備單因素實驗 填充劑的選擇：分別比較乳糖、甘露醇、山梨糖醇、甘露醇與山梨糖醇混合物（1:1）四種填充劑[18]，按照1.2.4 中的方法進行綜合評價選出最佳填充劑。

填充劑的用量：根據上述實驗結果，選擇填充劑與多糖浸膏的質量比為6:1、8:1、10:1、12:1、14:1，按照1.2.4 中的方法進行綜合評價確定最佳用量。

硬脂酸鎂的用量：比較不同硬脂酸鎂的添加量為總質量的0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，按照

1.2.4 中的方法進行綜合評價確定最佳用量。

維生素C的用量：比較維生素C的添加量2、3、4、5、6 g/kg，按照1.2.4 中的方法進行綜合評價確定最佳用量。

1.2.3.3 含片制備正交試驗 在單因素實驗的基礎上，選取填充劑山梨糖醇與甘露醇混合物（1:1）、硬脂酸鎂用量和維生素C 用量三個因素進行正交試驗。以此確定填充劑與多糖的最佳比值、硬脂酸鎂和維生素C的最佳用量。根據單因素實驗的結果，設置三因素三水平正交試驗，見表2。

表2 羊肚菌含片正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels tabke of orthogonal experiment of Morchellabuccal tablets

1.2.4 含片綜合評價 邀請20 名具有豐富經驗的感官評價員，分別從含片的風味、口感、組織狀態、色澤四個方面進行評分鑒定。風味、口感各占30 分，組織狀態占25 分，色澤占15 分，滿分100 分[19]，評價標準見表3。以感官評價70 分、硬度15 分、脆碎度10 分、崩解時限5 分、總分100 分為綜合評分指標，對含片進行綜合評價，綜合評價表見表4。

表3 感官評價標準表Table 3 Sensory evaluation standard table

表4 含片綜合評價表Table 4 Comprehensive evaluation table of buccal tablets

1.2.5 含片質量檢測

1.2.5.1 片重差異的測定 按照2020 年版《藥典》片劑章節所述方法測定。

1.2.5.2 多糖含量的測定 使用苯酚-硫酸法測定。

1.2.5.3 硬度的測定 制備三個批次的含片，每批次隨機選出二十顆，使用片劑四用測定儀測定。

1.2.5.4 脆碎度的測定 取20 片樣品吹去表面粘附的粉末并稱量其質量A，置于片劑四用測定儀中4 min轉動100 r，結束后取出吹去表面的粉末并稱量其質量B，按照以下公式計算脆碎度。

式中，A 表示檢測前質量，g；B 表示檢測后質量g；

1.2.5.5 崩解時限測定 利用量筒靜態法[20]測定，將羊肚菌多糖含片放入盛有2 mL 去離子水的10 mL量筒中，水溫37 ℃，放入含片后開始計時，觀察含片至沒有崩散現象停止計時，記錄崩解時長。

1.2.6 含片抗氧化活性研究

1.2.6.1 羥自由基清除能力測定 參考Opa 等[21]的方法并加以改良，精確配制9.0 mmol/L的水楊酸溶液、9.0 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、9.0 mmol/L的過氧化氫溶液，和不同濃度的樣品溶液（0.02、0.2、2、4、8、10 mg/mL），準確移取不同樣品溶液2 mL 于試管中，準備空白組，并分別向每管溶液中準確移取2 mL 硫酸亞鐵溶液、過氧化氫溶液、水楊酸溶液，37 ℃的恒溫水浴30 min，用去離子水作參比溶液，510 nm 測其吸光度，每組實驗設置三次平行，以維生素C 作為陽性對照，得到結果按照以下公式計算：

式中，Ax表示樣品清除羥自由基后的吸光值；Axo表示樣品本身的吸光值；Ao表示空白組的吸光值。

1.2.6.2 清除DPPH 自由基實驗 參考Ma 等[22]的方法并加以改良，準確配制0.05 mg/mL的DPPH 溶液、0.02、0.2、2、4、8、10 mg/mL的樣品溶液，準確移取2 mL 不同濃度樣品溶液于試管中，分別加入4 mL 濃度為0.05 mg/mL的DPPH 溶液，避光反應30 min,以去離子水為參比溶液，517 nm 測其吸光度值，每組實驗設置三次平行，以維生素C 作為陽性對照，結果按以下公式計算：

式中，Ax表示樣品清除DPPH 自由基后的吸光值；Axo表示樣品本身的吸光值；Ao表示空白組的吸光值。

1.3 數據處理

響應面試驗數據使用Design-Expert 8.05 軟件處理，正交實驗數據使用正交助手Ⅱ v3.1 軟件處理，其他數據使用Excel 2010 處理。

2 結果和分析

2.1 檢測羊肚菌多糖含量

2.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制 以吸光值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，結果見圖1。

圖1 葡萄糖溶液的標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose solution

由圖1 可知，葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=16.286x?0.0271，R2=0.997，吸光度值和多糖濃度在0～0.028 mg/mL 之間具有良好的線性關系，代入精多糖的吸光度求出換算系數f=1.23，將其代入提取得率公式即可計算出提取得率。

2.2 羊肚菌提取單因素實驗

2.2.1 液料比對羊肚菌多糖提取得率的影響 液料比對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖2 所示，隨著液料比的上升，羊肚菌多糖的提取得率先上升后下降，當液料比在10:1～25:1（mL/g）之間呈上升趨勢，液料比達到25:1（mL/g）時，提取得率達到最大值9.28%，當液料比大于25:1（mL/g）時，提取得率呈現下降趨勢，原因可能是，液料比大于25:1（mL/g）時，加入的蒸餾水多，稀釋了酶的濃度。實驗得出可將液料比為20:1～30:1（mL/g）列為進一步優化的范圍。

圖2 液料比對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.2 酶解時間對羊肚菌多糖提取得率的影響 酶解時間對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖3 所示，隨著酶解時間的延長，羊肚菌多糖提取得率呈先上升后下降的趨勢，當酶解時間低于2 h 時，多糖的提取得率逐漸上升，當酶解時間為2 h 時，羊肚菌多糖的提取得率達到最大值8.55%，大于2 h 時，羊肚菌多糖的提取得率呈下降趨勢。其原因有可能是酶解時間的延長，使得酶開始失活，且多糖結構發生降解，導致提取得率下降[23]，由此可得適宜的酶解時間為2 h。

圖3 酶解時間對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.3 酶解pH 對羊肚菌多糖提取得率的影響 酶解pH 對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖4 所示，隨著酶解pH的增大，羊肚菌多糖提取得率呈先上升后下降的趨勢。當酶解pH 小于5.0 時，羊肚菌多糖的提取得率呈上升趨勢，當酶解pH 等于5.0 時，羊肚菌多糖提取得率達到最大值9.57%,當酶解pH 大于5.0 時，羊肚菌多糖的提取得率下降，其原因可能為pH 影響酶的活性。由此可得最佳酶解pH 為5.0，據研究，纖維素酶最適pH 為4.5～6.0，木瓜蛋白酶最適pH 為5.0～7.0，因此該pH 為5.0 時效果較好與兩種酶的最適pH 具有一致性。

圖4 酶解pH 對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.4 酶用量對羊肚菌多糖提取得率的影響 酶用量對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖5 所示，隨著酶用量增大，羊肚菌多糖提取得率呈現上升趨勢。當酶用量為1.4%，羊肚菌多糖提取得率達到8.48%；當酶用量少于1.4%時，羊肚菌多糖的提取得率呈現快速上升趨勢；當酶用量大于1.4%時，羊肚菌多糖提取得率呈緩慢上升趨勢，其原因可能是當酶用量達到一定量時，底物大部分被反應完，故提取得率上升趨勢極緩慢，結合成本考慮，確定酶用量為1.4%。

圖5 酶用量對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.5 超聲波處理時間對羊肚菌多糖提取得率的影響 超聲波處理時間對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖6 所示，隨著超聲波處理時間的延長，羊肚菌多糖提取得率呈現先上升后下降的趨勢，當超聲波處理時間少于20 min 時，羊肚菌多糖的提取得率呈現上升趨勢，當超聲波處理時間為20 min 時，羊肚菌多糖提取得率達到最大值8.51%,當超聲波處理時間大于20 min 時，羊肚菌多糖的提取得率下降，原因可能是超聲時間過長，多糖鏈的結構被破壞，導致提取得率下降[24]。由此可得超聲波較優的處理時間為20 min。

圖6 超聲波處理時間對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.3 羊肚菌提取響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面優化試驗結果 對響應值進行多元回歸擬合[25]，得到多糖含量與各因素的二次多項回歸方程，提取得率Y=9.28+0.34A?0.069B?0.23C+0.21AB+0.26AC?0.28BC+0.26AC?0.28BC?0.24A2?0.32B2?0.50C2，R2=0.9323。試驗設計及結果見表5。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of response surface test

F值越大表明該因素對含量影響越顯著，各因素對羊肚菌多糖含量的影響大小依次為：A-液料比>C-超聲時間>B-酶解pH。其中A、C、AC、BC、A2、B2、C2為顯著性因子項。對模型進行顯著性檢驗，模型的F為10.70，P<0.01，模型因子具有極顯著性意義。該模型的失擬項F為0.77，P>0.05，無顯著性差異，回歸方程與實際擬合的非正常誤差所占的比例較小，能反映實際情況，說明是可靠的、合適的、有意義的表6。

表6 回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equation

2.3.2 響應面圖及等高線圖分析 通過響應面試驗得到多元二次回歸模型所作響應面圖和等高線圖如圖7 所示，對回歸模型進行分析，得到羊肚菌多糖提取的最佳工藝為：液料比為28.62:1（mL/g）、酶解pH 為5.08、超聲波處理時間為19.55 min，此工藝下羊肚菌多糖提取得率為9.40%。為方便操作，將羊肚菌多糖的提取工藝修改為:液料比29:1（mL/g）、酶解pH 為5.1、超聲波處理時間20 min。經實驗驗證，羊肚菌多糖得率為9.21%，此工藝優化效果明顯。

圖7 不同兩因素交互作用對羊肚菌多糖提取得率影響的響應面圖及等高線圖Fig.7 Response surface diagram and contour map of the interaction of different two factors on the extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.4 含片制備單因素實驗結果

2.4.1 填充劑的選擇對含片的影響 四種填充劑均不粘沖、片劑成形情況均良好。但乳糖和甘露醇的吸濕率低，成型的片劑太硬，不利于含服融化。山梨糖醇吸濕率高，成型的片劑脆碎度相對較高，易掉粉。結合乳糖不耐受癥患者由于體內缺乏乳糖酶導致不能消化吸收乳糖而不宜食用[26]，故確定填充劑為山梨糖醇:甘露醇=1:1 組合，壓出來的片劑硬度適中、口感好、適用人群較廣，且糖醇類不易引起齲齒，不會大幅度引起血糖的上升。在濕度較低的干燥環境下所測得填充劑吸濕率如圖8 所示，綜合得分如圖9 所示。

圖8 不同填充劑的吸濕曲線圖Fig.8 Moisture absorption curves of different fillers

2.4.2 山梨糖醇、甘露醇混合物與多糖浸膏的比值對含片的影響 山梨糖醇、甘露醇混合物與多糖浸膏的比值對含片的影響如圖10 所示，隨著比值的增大，含片的綜合得分呈現先上升后下降的趨勢，當比值為8:1 時，綜合得分達到最大，比值大于8:1 時，綜合得分下降，原因可能在于多加的填充劑降低了多糖的濃度，降低了含片的功能性。由此可得最佳山梨糖醇、甘露醇混合物與浸膏比值為8:1。

圖10 山梨糖醇、甘露醇混合物與多糖浸膏比值綜合評分圖Fig.10 Comprehensive score chart of ratio of sorbitol,mannitol mixture and polysaccharide extract

2.4.3 硬脂酸鎂的添加量對含片的影響 硬脂酸鎂的添加量對含片的影響如圖11 所示，隨著硬脂酸鎂添加量的增大，含片的綜合得分呈現先上升后下降的趨勢，當添加量為1.0%時，綜合得分達到最大，添加量大于1.0%時，綜合得分下降，原因可能在于硬脂酸鎂的添加量過大，影響了含片的崩解時限。

圖11 硬脂酸鎂添加量對含片的綜合評分圖Fig.11 Comprehensive score chart of magnesium stearate addition on buccal tablets

2.4.4 維生素C的添加量對含片的影響 維生素C 添加量對含片的影響如圖12 所示，隨著維生素C 添加量的增大，含片的綜合得分呈現先上升后下降的趨勢，當添加量為4 mg/g 時，綜合得分達到最大，當添加量大于4 mg/g 時，綜合得分下降，原因在于維生素C的添加量增加引起口感的變化，含片變酸。

圖12 維生素C 添加量對含片綜合評分圖Fig.12 Comprehensive score chart of vitamin C addition on buccal tablets

2.5 含片制備正交實驗結果

由表7 可知，3 個因素對結果影響的大小為A>B>C,即填充劑與多糖的比值>維生素C的添加量>硬脂酸鎂的添加量，填充劑與浸膏的比值對含片整體的影響最大，硬脂酸鎂的添加量對含片整體的影響最小。最優組合為A2B3C1,最佳的制備工藝為填充劑與多糖的比值為8:1、維生素C的添加量5 mg/g、硬脂酸鎂的添加量為0.8%。

表7 含片正交實驗結果表Table 7 Orthogonal test results of buccal tablets

2.6 含片質量檢測結果

多糖含片片重差異為3.2%（低于5%）、脆碎度為0.5%±0.1%，兩項指標符合2020 年版《中國藥典》的標準；羊肚菌多糖含量為8.5%±0.5%；崩解時限為12 min、硬度為（126.4±3.0）N，該兩項指標 在2020 年版《中國藥典》中未做規定，主要影響到產品得分綜合評價，測量值符合評分要求。

2.7 抗氧化活性研究結果

2.7.1 清除羥自由基實驗 羥基自由基（·OH）清除能力測定：如圖13 所示，在羊肚菌多糖含片濃度0.02～10 mg/mL的范圍內，羊肚菌多糖含片對·OH的清除率隨濃度的增大而不斷增大，呈現一定的量效關系，羊肚菌多糖含片10 mg/mL 時對羥自由基清除率高達46.78%，研究結果表明，羊肚菌多糖含片有良好的羥自由基清除能力。含片中作為輔助原料的維生素C，在樣液中的濃度遠低于陽性對照維生素C的濃度（濃度比為1:200），因此，含片對羥自由基的清除能力主要是羊肚菌多糖的作用，配方中維生素C 或起到一定的協同效果。

圖13 羊肚菌多糖含片和維生素C 對羥自由基的清除能力Fig.13 Scavenging ability of Morchella esculenta polysaccharide buccal tablets and vitamin C on hydroxyl radical

2.7.2 清除DPPH 自由基實驗 DPPH 自由基清除能力測定：如圖14 所示，羊肚菌多糖含片濃度在0.02～10 mg/mL的范圍內，對DPPH 自由基的清除率隨濃度增大而增大，呈現一定的量效關系，表現出穩定的清除能力。當羊肚菌多糖含片濃度為10 mg/mL時，清除率達到75.38%，證明多糖含片有極好的清除DPPH 自由基的能力。同理，含片對DPPH 自由基的清除能力主要是羊肚菌多糖的作用。

圖14 羊肚菌多糖含片和維生素C 對DPPH 自由基的清除能力Fig.14 Scavenging ability of Morchella elculenta polysaccharide buccal tablets and vitamin C on DPPH free radicals

3 結論

羊肚菌多糖提取中，設置單因素實驗，通過分析方差挑選出3 個對提取得率影響較顯著的因素進行響應面優化處理，得到最終的結果為液料比29:1 mL/g、酶解pH 為5.1、超聲波處理時間20 min、酶解時間為2 h、酶用量為1.4%；制備含片部分，設計單因素實驗挑選出最佳的填充劑、填充劑和提取物的適用量、維生素C的適用量、硬脂酸鎂的適用量，并在此基礎上設計三水平三因素正交試驗，探索出各因素最佳用量，最終配方為：填充劑為山梨糖醇:甘露醇=1:1 混合粉末，填充劑與多糖提取物比值為8:1，維生素C的使用量為5 mg/g，硬脂酸鎂的用量為0.8%；在檢測部分所得結果如下：含片的pH 為6.3±0.1，硬度為（126.4±3.0）N，脆碎度為0.5%±0.1%，崩解時限為12 min，多糖含量（31.4±0.5）mg/粒，含片濃度為10 mg/mL 時，羥自由基清除率為46.78%，DPPH 自由基的清除率為75.38%，抗氧化活性良好。本研究對高效提取羊肚菌多糖并加工成易于攜帶、便于進食、口感優良的羊肚菌多糖功能食品，具有一定的參考價值，后續可以在功能機理上作更深入的研究；同時也可以將羊肚菌多糖在其他保健功能如緩解疲勞、預防腫瘤等功能產品的開發與應用上做更廣泛的研究與探討。