超聲輔助提取毛酸漿籽蛋白質的工藝優化

苗欣月，朱立斌，朱 丹，牛廣財, ，魏文毅，寧志雪

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319）

毛酸漿（Physalis pubescensL.）是茄科酸漿屬的一年生草本植物，又名黃菇娘，其成熟果實呈金黃色，可食藥兼用[1]。毛酸漿已被用于清熱解毒、治療咳嗽和泌尿生殖系統疾病等，還具有預防腫瘤、抗氧化、抗癌、降血脂和降血糖等功能[2?8]。毛酸漿籽作為毛酸漿在加工生產過程中產生的副產物，由于得不到有效利用而被丟棄或被作為下腳料處理[9]。目前，已有大量關于毛酸漿果實方面的研究報道[10?13]，但有關毛酸漿果籽方面的研究較少，關于毛酸漿籽中蛋白質的提取及其性質的研究更是鮮見報道。郝曉磊等[14]、陸占國等[9]分別采用索氏微波提取法和超臨界CO2流體萃取法提取了毛酸漿籽油，并分析鑒定出毛酸漿籽油的脂肪酸組成為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、十六（烷）酸、十八（烷）酸、亞油酸乙酯和硬脂酸等，其不飽和脂肪酸含量占81.0%～85.12%。張舵等[15]采用堿提酸沉法確定了紅菇娘籽中蛋白質的最佳提取工藝條件，即在料液比為1:7，pH8.0，水浴溫度45 ℃，酸沉最佳pH 為4.0 時，紅菇娘籽蛋白質的提取率為52.68%。

目前，提取植物蛋白的主要方法有酶解法、堿溶酸沉法、超聲輔助法等。酶解法提取條件溫和，但是提取溫度不宜過高，否則蛋白質不易從植物細胞壁中溶出，導致提取效果不佳[16]。堿溶酸沉法提取率較低，提取時間長，也會改變活性物質的結構和性質[17]。而超聲輔助提取技術具有的空穴效應可產生較強的機械剪切力，有利于蛋白質從固體物料中溶出，具有提取效率高、提取時間短等優點[18]。唐詩琦等[19]采用超聲輔助堿法確定了辣木籽蛋白質的最優提取工藝條件為：pH8.0，提取時間45 min，提取溫度44 ℃，超聲功率150 W，此條件下辣木籽蛋白的提取率為44.03%。馬夢婷等[20]確定了超聲輔助堿提棉籽蛋白的最優工藝條件為pH 11.0，液料比20:1 mL/g，超聲時間20 min，超聲溫度45 ℃，超聲功率600 W，在此條件下棉籽蛋白提取率為87.64%。

本試驗擬采用超聲輔助法提取毛酸漿籽中的蛋白質，并通過正交試驗對毛酸漿籽中蛋白質的提取工藝進行優化，分析超聲輔助提取的毛酸漿籽蛋白質的溶解性、乳化性和起泡性，以期為毛酸漿籽蛋白質的開發利用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛酸漿籽 大慶地產毛酸漿，品種為鐵把小菇娘（physalis pubescensTieba），毛酸漿打漿后經紗布過濾、水洗，干燥后得到毛酸漿籽，毛酸漿粗蛋白含量為5.37%，粗脂肪含量為2.89%；牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G-250 蛋白試劑 上海邁坤化工有限公司；乙醇 分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；硫酸鉀、硫酸銅、硫酸等 均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司；十二烷基硫酸鈉 美國Sigma 公司。

DK-600B 電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司；LE203E/02 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QDN-11 全自動凱氏定氮儀 杭州匯爾儀器設備有限公司；Beta2-8LD plus 冷凍干燥機德國Christ 公司；KH-500DE 型超聲波清洗器昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛酸漿籽蛋白質提取工藝 參考李逸鶴等[21]的方法并稍加修改。將毛酸漿籽粉碎后置于真空干燥箱，45 ℃條件下干燥24 h，過40 目篩。取適量經預處理后的毛酸漿籽粉，用石油醚（料液比1:5 g/mL）浸泡1 h，重復操作兩次，干燥后置于4 ℃冰箱貯存。實驗時，將2.0 g 毛酸漿籽粉按1:15 g/mL的料液比分散到蒸餾水中，加堿調節至一定的pH。一定溫度下水浴30 min，在設定的超聲功率、提取時間、提取溫度下進行毛酸漿籽粉中蛋白質的提取。超聲輔助提取結束后，在轉速為4500 r/min 條件下離心20 min 取上清液。滴加HCl 溶液（1 mol/L）使上清液pH 至4.0，離心取沉淀蛋白質，加入蒸餾水將pH 調至7.0，最后冷凍干燥得到毛酸漿籽蛋白質粉。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 超聲功率的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調pH 至9.0，充分攪拌混勻后水浴30 min，分別選擇超聲功率100、200、300、400、500 W 于溫度20 ℃條件下超聲提取20 min，計算毛酸漿籽蛋白質的提取率，確定毛酸漿籽蛋白質的最適超聲功率。

1.2.2.2 提取溫度的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調pH 至9.0，充分攪拌混勻后水浴30 min，分別選擇不同提取溫度20、30、40、50、60 ℃于功率300 W的條件下超聲提取20 min，計算毛酸漿籽蛋白質的提取率，確定毛酸漿籽蛋白質的最適提取溫度。

1.2.2.3 提取時間的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調pH 至9.0，充分攪拌混勻后水浴30 min，固定提取溫度20 ℃，超聲功率300 W，考察不同提取時間（20、30、40、50、60 min）對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響，確定毛酸漿籽蛋白質的最適提取時間。

1.2.2.4 提取液pH的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調節pH 分別為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，充分攪拌混勻后水浴30 min，在提取時間20 min，超聲功率300 W，提取溫度20 ℃下進行實驗，計算毛酸漿籽蛋白質提取率，確定毛酸漿籽蛋白質的最適提取液pH。

1.2.3 正交試驗設計 根據單因素實驗結果，采用L9（34）正交設計優化毛酸漿籽蛋白質的提取條件，具體因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 蛋白質提取率測定 采用考馬斯亮藍染色法測定上清液中蛋白質的含量[22]，毛酸漿籽中總蛋白質含量用凱氏定氮法進行測定[23]，毛酸漿籽蛋白質提取率計算公式如下：

1.2.5 毛酸漿籽蛋白質等電點測定 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 溶液將毛酸漿籽蛋白質提取液的pH 分別調至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，靜置一段時間后，離心（4500 r/min，20 min），取上清液比色測定，吸光值最小的即為等電點。

1.2.6 毛酸漿籽蛋白質功能特性的測定

1.2.6.1 溶解性的測定 參考許英一等[24]的方法稍加修改。配制2.5%的樣品溶液，滴加HCl（1 mol/L）或 NaOH 溶液（1 mol/L）使pH 分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，室溫振蕩30 min，于6000 r/min 條件下離心20 min，上清液中氮含量采用微量凱氏定氮法進行測定。蛋白質溶解性用氮溶解指數（NSI）來表示，計算公式如下：

1.2.6.2 乳化性的測定 參考李永恒等[25]的方法稍加修改。配制100 mL 濃度為2%的毛酸漿籽蛋白溶液，滴加HCl（1 mol/L）或 NaOH 溶液（1 mol/L）使pH 分別在3.0～10.0。分別取30 mL 溶液并加入液油體積比為4:1的大豆色拉油5 mL，用勻漿機（10000 r/min）攪拌2 min 后，從燒杯底部取樣50 μL加入到0.1% SDS 溶液中，以0.1% SDS 溶液作為空白對照，于500 nm 下測定吸光值A0。乳化性（EAI）計算公式如下：

式中：A0—樣品的吸光值；N—稀釋倍數；φ—油相所占的體積分數；L—比色皿的光路長度，1 cm；c—毛酸漿籽蛋白質的質量濃度，g/mL。

1.2.6.3 起泡性的測定 參考李超楠等[26]的方法稍加修改。配制100 mL 濃度為2%的毛酸漿籽蛋白溶液，滴加HCl（1 mol/L）或 NaOH 溶液（1 mol/L）使pH 分別至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。攪拌1 h 后，以5000 r/min的轉速離心15 min，用勻漿機（10000 r/min）攪拌2 min 后，立即測定泡沫體積V0，起泡性（FA）的計算公式如下：

1.3 數據處理

每個試驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示，應用SPSS 19.0 對試驗數據進行顯著性分析，當P<0.05 差異顯著，P>0.05 無顯著差異；采用Origin軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲功率對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響從圖1 可知，當超聲功率從100 W 升至200 W 過程中，毛酸漿籽蛋白質提取率隨著功率的增加顯著增加（P<0.05），并在功率200 W 時達到最大值63.60%。這可能是由于超聲產生的空化效應使毛酸漿籽粉細胞中的結構被破壞，加速了毛酸漿籽粉中蛋白質的溶出，有利于蛋白質的提取[27]。功率在200 W 與300 W時對蛋白質提取率的影響差異不顯著（P>0.05），而當超聲功率高于300 W，毛酸漿籽中的蛋白質提取率開始顯著降低，產生這種現象主要是因為當超聲功率逐漸升高時，溶液溫度也隨之升高，從而導致蛋白質的結構改變，引起毛酸漿籽蛋白質破壞，從而影響蛋白質提取率[28]。因此，選擇超聲功率100、200、300 W 進行后續優化實驗。

圖1 超聲功率對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.1.2 提取溫度對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響由圖2 可知，提取溫度在20 ℃到40 ℃范圍時，毛酸漿籽蛋白質的提取率顯著上升（P<0.05），這是因為適當的溫度有利于毛酸漿籽中的蛋白質從細胞中溶出，同時提高了毛酸漿籽蛋白質的溶解度，從而有利于毛酸漿籽蛋白質的提取。當溫度高于50 ℃時，毛酸漿籽蛋白質發生變性，溶解性降低，不利于毛酸漿籽粉中蛋白質的提取[21]。因此，選擇提取溫度30、40、50 ℃進行后續優化實驗。

圖2 提取溫度對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.1.3 提取時間對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響由圖3 可知，當提取時間由20 min 增加到50 min時，毛酸漿籽蛋白質的提取率顯著上升（P<0.05），在50 min 時提取率達77.89%，隨后顯著下降，這可能是由于超聲產生的空化作用使毛酸漿籽蛋白質在很短的一段時間內能最大限的溶出，從而增加了蛋白質的提取率；隨著提取時間繼續增加，可能會使蛋白質部分變性，不利于毛酸漿籽蛋白質的提取[26]。因此，選擇提取時間40、50、60 min 進行后續優化實驗。

圖3 提取時間對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.1.4 提取液pH 對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響由圖4 可知，當pH 由7.0 升至9.0 時，隨著pH的增加，蛋白質提取率顯著增加（P<0.05），在pH 9.0 時達到最高值68.18%，這可能是因為毛酸漿籽中的蛋白質在稀堿溶液中發生水解，蛋白質分子間相互排斥，對蛋白質分子有增溶作用，使毛酸漿籽蛋白質的提取率增加[17]。但隨著提取液pH 繼續增大，毛酸漿籽蛋白質的提取率呈逐漸下降的趨勢，這可能是由于堿性條件增加了毛酸漿籽蛋白質的水解性，在酸沉時也會造成部分蛋白質的損失；且堿性過強會使蛋白質變性和水解，造成提取蛋白質的品質下降[24,29]。因此，選擇提取液pH8、9、10 進行后續優化實驗。

圖4 提取液pH 對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.2 正交試驗結果與分析

在單因素實驗的基礎上，按L9（34）正交表對毛酸漿籽蛋白質提取率的各影響因素進行正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2 可知，影響毛酸漿籽蛋白質提取率的各因素的主次順序為：提取溫度（A）>超聲功率（D）>提取液pH（B）>提取時間（C）。最佳工藝組合為A3B2C2D3，即最佳提取條件為提取溫度50 ℃、功率300 W、提取液pH 9.0、提取時間50 min。

表3 為該正交試驗的方差分析結果。由表3 可知，考察的4 個因素中：提取溫度對毛酸漿籽蛋白質提取率有較大的影響，差異極顯著（P<0.01）；提取液pH 及超聲功率對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響顯著（P<0.05）；而提取時間對毛酸漿籽蛋白質提取率的影響不顯著（P>0.05）。

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 驗證性試驗

為驗證超聲輔助法提取毛酸漿籽蛋白質的穩定性和有效性，選取由正交試驗最佳工藝A3B2C2D3，即在提取時間50 min、提取溫度50 ℃、提取功率300 W、提取液為pH 9.0的條件下進行穩定性試驗。此工藝條件下通過實驗得到毛酸漿籽蛋白質的提取率為90.45%±0.16%。因此，此工藝條件對毛酸漿籽蛋白質的提取具有較好的可行性。

2.4 毛酸漿籽蛋白質等電點的測定

由圖5 可知，pH 在3.0～5.5 范圍內，吸光值隨pH的增加呈先下降后升高，且pH 在4.0 時的吸光值最小，說明此pH 條件下蛋白質沉淀最多，此時的pH 即為毛酸漿籽蛋白質的等電點。

圖5 毛酸漿籽蛋白質等電點的測定Fig.5 Determination of isoelectric point of Physalis pubescens L.seeds protein

2.5 毛酸漿籽蛋白質的特性研究

2.5.1 毛酸漿籽蛋白質溶解性 由圖6 可知，當pH由2.0 升至10.0，毛酸漿籽蛋白質的氮溶解指數先下降后升高；pH 為4.0 時，氮溶解指數達到最小值14.59%。這可能是因為在等電點（pH4.0）附近時，蛋白質分子內的凈電荷為0，分子顆粒間相互作用力減弱而發生碰撞、聚集，產生沉淀，此時蛋白質的溶解度最低；當pH 遠離等電點時，蛋白質與水分子之間的相互作用增強，蛋白質的水溶性提高，從而增加了蛋白質的溶解性[24,30]。在pH 為10.0 時，氮溶解指數達到最高值58.32%。

圖6 pH 對毛酸漿籽蛋白質溶解性的影響Fig.6 Effect of pH on solubility of Physalis pubescens L.seeds protein

2.5.2 毛酸漿籽蛋白質乳化性研究 由圖7 可知，毛酸漿籽蛋白質的乳化性隨pH的增加先降低后升高，在pH 為4.0 時呈現最小值，這可能是因為處于等電點附近時毛酸漿籽蛋白質的溶解度最低，且無凈電荷，所以蛋白質乳化能力較弱[31]。在pH 為10.0 時，乳化性達到68.94 m2/g。

圖7 pH 對毛酸漿籽蛋白質乳化性的影響Fig.7 Effect of pH on emulsification of Physalis pubescens L.seeds protein

2.5.3 毛酸漿籽蛋白質起泡性研究 由圖8 可知，當pH 由3.0 升至7.0，毛酸漿籽蛋白質的起泡性先降低后升高。pH 為4.0 時呈現最小值，這可能是因為在等電點附近時未溶解的毛酸漿籽蛋白質較多，起泡性較弱。而在pH7.0 時呈現最大值43%，但繼續增加pH，則起泡性又降低，說明過酸或過堿條件都不利于毛酸漿籽蛋白質的起泡。

圖8 pH 對毛酸漿籽蛋白質起泡性的影響Fig.8 Effect of pH on foaming characteristic of Physalis pubescens L.seeds protein

3 結論

本研究在單因素實驗基礎上,通過正交試驗優化了超聲輔助法提取毛酸漿籽中蛋白質的提取條件，即在提取溫度50 ℃、功率300 W、提取液pH 9.0、提取時間50 min的條件下，毛酸漿籽蛋白質的提取率可達90.45%±0.16%。超聲輔助法提取毛酸漿蛋白質的功能特性表明，在等電點pH4.0 附近，毛酸漿籽蛋白質的溶解性、起泡性和乳化性最弱，pH 為7.0 時，毛酸漿籽蛋白質的起泡性最好，且毛酸漿籽蛋白質在強堿性溶液中有較好溶解性。后續將進一步研究毛酸漿籽蛋白質的結構和凝膠特性。