外源添加物對鰱魚-鱈魚復合魚糜凝膠性能的影響

張一鳴，李思儀，沈曉溪，石晨暉，尚宏麗

（錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121001）

魚糜是以不同種類魚肉為原料并經過清洗、采肉、漂洗、脫水等關鍵步驟所制備的深加工魚肉制品，為一種優質的高蛋白食品，一直深受國內外消費者的喜愛。魚糜制品的原料大多都是采用海水魚，其主要原因是海水魚中的肌原纖維蛋白含量較高，其凝膠性能顯著優于淡水魚類魚糜[1]。但是單一海水魚所制魚糜，其成本較高，生產費用顯著提升，因此魚糜生產廠家一直致力于研發海水魚和淡水魚復合魚糜制品，且復合魚糜制品的凝膠性能優于單一魚糜制品[2]。我國鰱魚產量大，且肉薄刺多、脂肪較低并且不易保存，在市面上主要以鮮銷為主。而我國海水魚中鱈魚，其營養豐富，在我國生產量大，因此本研究預將鰱魚與鱈魚復合制成魚糜，彌補淡水魚魚糜的不足[3]，同時豐富魚糜制品的多樣性。

檢驗魚糜品質的優劣最重要的指標就是魚糜凝膠強度。Hongbo Mi[4]研究表明淀粉類對于魚糜凝膠有較明顯的改善，以此為基礎可以嘗試將不同外源添加物復配改善復合魚糜凝膠特性。谷氨酰胺轉氨酶（Glutamine transaminase,TGase）也可以有效改善蛋白質的凝膠性能，這是因為它能催化肌球蛋白上賴氨酸的ε－氨基和谷氨酸殘基上的γ－酰胺基形成共價鍵，使蛋白質之間或蛋白質內部發生相互作用，可以用來提升魚糜的粘彈性[5?6]。同時有研究表明，淀粉可以提高魚糜的持水性，使魚糜擁有良好的吸水性和黏著性；蛋清蛋白具有較好的凝膠性能，添加后還可以使魚糜中水分、脂肪、肌肉蛋白質和淀粉等成分形成穩定均勻的系統，繼而提升魚糜制品的持水性和嫩度等[7?8]。

本研究以鰱魚與鱈魚為主要原料，選擇外源添加物馬鈴薯淀粉、谷氨酰胺轉氨酶（TGase）以及蛋清蛋白的添加量為單因素，以復合魚糜凝膠強度為響應值，采用Box-Behnken 響應面優化鰱魚與鱈魚復合魚糜凝膠性能，同時利用質構測定分析和掃描電鏡對其外源添加物作用機理進行初步探究，旨在為開發凝膠性能較強，成本低的鰱魚與鱈魚復合魚糜制品提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚、鱈魚 錦州市古塔區農貿海鮮綜合市場；谷氨酰胺轉氨酶（TGase） 江蘇一鳴生物股份有限公司，酶活100 IU/g；蛋清蛋白 蘇州歐福蛋業股份有限公司；食鹽、馬鈴薯淀粉 錦州市超市。

QTS－25 型質構儀 美國 Brookfield 公司；FA1004 型電子天平、HH-4 型數顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；ZB－50 型斬拌機揭東縣港美吳哲食品機械廠；FW100型高速勻漿組織搗碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；80-2 型高速離心機 江蘇省金壇新瑞儀器制造有限公司；KYKY-EM8000F 型掃描電鏡 北京中科科儀股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合魚糜制作過程 參考王玉鳳等[9]的方法并稍作修改，將新鮮鰱魚、鱈魚頭、尾、內臟去除后用清水清洗干凈，將魚肉和皮、骨分離并將魚肉攪碎后在常溫下漂洗（魚肉:水的比例為1:5～1:10），鰱魚與鱈魚按照5:1的比例復合并加入輔料及添加劑后調節至水分含量為70%[10]，加入2.5% NaCl 擂潰成型，再利用二段式加熱（40 ℃水浴加熱30 min，90 ℃水浴加熱20 min）成為混合魚糜凝膠，將混合魚糜凝膠樣品冷卻后在4 ℃下貯藏。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 馬鈴薯淀粉的添加量對魚糜凝膠性能影響取200 g 復合魚糜，分別添加0%、4%、8%、12%、16%的馬鈴薯淀粉并充分攪拌，冷卻至室溫后放入冷藏溫度下貯藏，測定不同馬鈴薯淀粉添加量的魚糜凝膠性能。

1.2.2.2 TGase的添加量對魚糜凝膠性能影響 取200 g 復合魚糜，分別添加0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的TGase 充分攪拌，冷卻至室溫后放入冷藏溫度下貯藏，測定不同TGase 添加量的魚糜凝膠性能。

1.2.2.3 蛋清蛋白添加量對魚糜凝膠性能影響 取各200 g 復合魚糜，分別添加1%、3%、5%、7%、9%的蛋清蛋白進行攪拌，冷卻至室溫后放入冷藏溫度下貯藏，測定不同蛋清蛋白添加量的魚糜凝膠性能。

1.2.3 響應面優化設計 利用Design-Expert 8.05軟件，根據Box-Behnken 設計原理，以復合魚糜凝膠強度為響應值，對復合魚糜制備工藝參數進行優化，試驗因素水平編碼如表1 所示[11]。

表1 響應面試驗的因素及水平設計Table 1 Factors and levels design of response surface test

1.2.4 復合魚糜凝膠性能的測定

1.2.4.1 復合魚糜凝膠強度的測定 將待測試魚糜樣品切成2 cm×2 cm×2 cm的長方體塊狀，通過質構儀在室溫狀態下進行凝膠化測定。選用P35 探頭,測前速率為1.00 mm/s,測中速率為1.00 mm/s,測后速率1.00 mm/s,壓縮程度為30 %,并且兩次壓縮間隔的時間為5.00 s,觸發力5.0 g,數據采集速率為400 p/s，每組測量平行4 次及以上，重復試驗3 次，結果取平均值[12]。

1.2.4.2 復合魚糜持水性測定 將待測樣品切成大約3 mm 厚度的薄片并稱重量（W1），先將3 張濾紙置于下方，上面再放2 張濾紙，用5 kg的重物壓制并保持2 min，取出濾紙，再次稱重（W2），持水性按下式計算：持 水性(%)=×100[13]

式中：W1—第一次稱重的質量（g）；W2—第二次稱重的質量（g）。

1.2.5 復合魚糜質構特性對比 質構剖面分析（TPA）能夠通過質構儀模擬人的口腔咀嚼動作來探討食品的質構特性，得到與人的感官評價相關的質構特性值。將優化工藝組（馬鈴薯淀粉添加量16%，TGase 添加量為0.4%，蛋清蛋白添加量為6%）與普通工藝組（馬鈴薯淀粉添加量、TGase 添加量、蛋清蛋白添加量均為0）分別進行TPA 試驗。使用質構儀測定各組樣品的硬度、彈性、咀嚼性、粘結性、破斷力、破斷距離，各組魚糜平行測定12 次，選用5 mm的通用柱形探頭的質構儀,測試前速率1.00 mm/s,測試中速率1.00 mm/s,測試后速率1.00 mm/s,30%的壓縮程度,并且兩次壓縮間隔的時間為5.00 s,觸發力5.0 g,數據采集速率為400 p/s[14]。

1.2.6 復合魚糜凝膠掃描電子顯微鏡（SEM）測定參考余永名等[15]的方法，略作修改。將魚糜凝膠切成3 mm×3 mm×3 mm 小塊，用 2.5%的戊二醛固定12 h，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH7.2）漂洗3 次，每次5 min，采用不同體積分數為 30%、50%、70%、90%、95%和100%的乙醇梯度脫水，15 min/次，最后將樣品放入真空冷凍干燥機中干燥8 h，離子濺射鍍金，用掃描電子顯微鏡觀察微觀結構。

1.3 數據處理

數據處理選用SPSS 21.0 軟件進行方差分析（ANOVA），P<0.05 為差異性顯著。所有指標檢測均測定三次取平均值加減標準差。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯淀粉添加量對復合魚糜凝膠強度以及持水性的影響

凝膠強度由凝膠的硬度和彈性共同體現，即凝膠破斷力和破斷距離的乘積，是反應復合魚糜凝膠性能的一個重要指標，由圖1 可知，隨著馬鈴薯淀粉添加量的增加，其復合魚糜凝膠強度明顯增強，當馬鈴薯添加量在8%時，其凝膠強度變化趨于平緩，此時凝膠強度為1430 g·cm，與對照組相比，凝膠強度提高了81%。增強復合魚糜凝膠強度原因主要是馬鈴薯淀粉在遇到較高溫度時，淀粉中的支鏈可以增強吸水性進而吸水膨脹從而形成凝膠，這樣蛋白質凝膠的網絡結構中就會填充淀粉凝膠，使復合魚糜凝膠的結構之間變得更加緊密[16]，馬鈴薯淀粉添加量對凝膠強度的影響差異顯著（P<0.05）。

圖1 馬鈴薯淀粉添加量對凝膠性能的影響Fig.1 Effect of potato starch addition on gel properties

魚糜凝膠的持水能力取決于肌球蛋白與肌動蛋白交聯形成的三維網絡結構，魚糜的持水性與魚糜的凝膠強度有一定的關系，共同反映了魚糜凝膠微觀網絡結構的緊密程度，以及對水分保留能力的強弱[17]。由圖1 可知，隨著馬鈴薯淀粉的添加量逐漸增加，持水性顯著性（P<0.05）增強，這與馬海建等[18]的研究一致，這是因為淀粉顆粒可以遇水后膨脹，可以明顯的保留住魚糜中的水分，增強魚糜持水性[19]。

2.2 谷氨酰胺轉氨酶（TGase）添加量對復合魚糜凝膠強度以及持水性的影響

由圖2 可知，隨著酶TGase 添加量的增加，復合魚糜凝膠強度先增加后降低，在0.2%～0.4%范圍之間，復合魚糜凝膠強度增強，在添加量超過0.4%之后，復合魚糜凝膠強度減弱，這與陳瑜等[20]研究結果一致。由于TGase 添加量的持續增多，凝膠強度反而下降，這可能是因為添加過多的TGase，會使蛋白質分子間過度交聯而破壞凝膠的網狀結構，TGase 作用在魚糜中形成了過多的ε（γ-谷氨酰）賴氨酸鍵，會讓魚糜凝膠變的又硬又脆，TGase 會使蛋白質分子間形成ε（γ-谷氨酰）賴氨酸鍵共價鍵，而其作用強度是氫鍵和疏水鍵的20 倍[21]，TGase的添加量在0.4%時最為合適。

圖2 TGase 添加量對凝膠性能的影響Fig.2 Effect of TGase on gel properties

由圖2 可知，復合魚糜持水性隨著TGase 添加量的增加而增強，在TGase 添加量為0.4%時，持水性達到最高值為94%，當添加量≥0.4%時，其持水性無顯著變化（P>0.05），因為加入TGase 能促進復合魚糜反應體系中谷氨酸的γ-酰胺基團與賴氨酸的ε-氨基產生交互反應，生成異肽鍵使蛋白分子之間或分子內互相交聯，改變蛋白質結構，對復合魚糜持水性有利。綜合而言，TGase 添加量濃度為0.4%時，復合魚糜凝膠性能最好。

2.3 蛋清蛋白添加量對復合魚糜凝膠強度以及持水性的影響

由圖3 可知，蛋清蛋白添加量在1%～5%之間，復合魚糜的凝膠強度呈逐步增長趨勢，當添加量為5%時，凝膠強度達到了最大值為2790 g·cm，高于對照組。蛋清蛋白作為一種活性黏連劑，能夠與蛋白質基質形成相互作用，通過影響破斷強度來改變魚糜的凝膠強度[22]。當添加量>5%后，凝膠強度下降，可能由于蛋清蛋白含量過高影響復合魚糜的破斷距離，破壞了復合魚糜的凝膠，從而導致了復合魚糜的凝膠強度變低，這與其他學者研究結果一致[23]。

圖3 蛋清蛋白添加量對凝膠性能的影響Fig.3 Effect of egg white protein on gel properties

由圖3 可知，當蛋清蛋白添加量<5%時，持水性隨著蛋清蛋白的增加而增強，當蛋清蛋白添加量為5%時，復合魚糜的持水性為85%，高于對照組11%，隨著持水性的不斷增高，復合魚糜的保水性在增強，魚糜的品質也會得到改善，當蛋清蛋白添加量>5%時，魚糜持水性變化不顯著（P>0.05）。綜合得到，蛋清蛋白添加量在5%最合適。

2.4 響應面分析法優化復合魚糜工藝試驗結果

2.4.1 方差和回歸分析 Box-Behnken 試驗設計的因素水平及結果如表2 所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experiment design and results of response surface experiment

表2 中共有17 個測試點，包括12 個析因點和5 個零點。試驗編號為1～12 為析因試驗，試驗編號為13～17 為中心試驗。析因點代表自變量取值在X1、X2、X3三個變量所構成的三維頂點，零點代表中心水平，此測試重復5 次，以估計誤差[24]。通過Design-Expert 8.05 軟件對表2 中的數據進行多元回歸擬合后，得到響應值（Y）與各因素（X1、X2、X3）的多元二次回歸方程:

2.4.2 復合魚糜凝膠強度的方差分析 根據 Box-Benhnken 試驗原理，結合單因素實驗結果，考察馬鈴薯淀粉（X1）、TGase（X2）及蛋清蛋白（X3）添加量對復合魚糜凝膠強度（Y）的影響，魚糜的品質與其凝膠強度呈正相關，因此常通過測定魚糜的凝膠強度值來評估其魚糜的品質[25]。方差分析結果如表3 所示。

表3 凝膠強度回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of gel strength regression model

由表3的方差分析結果可知，該試驗模型方程極顯著（P=0.0002<0.01），失擬項不顯著（P=0.4218>0.05），說明該回歸模型與實際值擬合的較好。回歸方程的二次項相關系數R2=96.64%，表明大約有97%的變異存在于3 個自變量當中，僅有約3%的總變異不能用回歸模型解釋[26]。所以，復合魚糜凝膠強度影響因素的真實值可以用該回歸方程加以分析和預測。通過表3 中的P值，可以看出蛋清蛋白添加量的一次項，馬鈴薯淀粉添加量二次項和蛋清蛋白添加量的二次項均達到了極顯著水平（P<0.01），但各因素之間的交互作用均不顯著，圖4-圖6 所示的是其交互作用的響應曲面圖。通過F值還可以看出，各因素對復合魚糜凝膠強度的影響顯著性次序為蛋清蛋白添加量>馬鈴薯淀粉添加量>TGase 添加量，說明各影響因素和響應值之間并不是普通的線性關系。

2.4.3 響應面分析 運用響應面軟件，根據凝膠強度的回歸方程所得響應面分析圖，可更直觀地反應出每個自變量之間的交互作用[27]。由圖4～圖6 可清楚的看到馬鈴薯淀粉添加量與蛋清蛋白的添加量的交互作用對于復合魚糜的凝膠強度影響較大，因為兩者交互的響應面圖比較陡，而馬鈴薯淀粉添加量與TGase 添加量交互以及TGase 添加量與蛋清蛋白添加量交互的響應面圖比較平緩，所以對復合魚糜凝膠品質影響不大。

圖4 馬鈴薯淀粉添加量與谷氨酰胺轉氨酶添加量對魚糜凝膠強度的三維曲面圖Fig.4 Three-dimensional curve of potato starch and glutamine transaminase on gel strength of surimi gel

圖5 馬鈴薯淀粉添加量與蛋清蛋白添加量對魚糜凝膠強度的三維曲面圖Fig.5 Three-dimensional curve of potato starch and egg white on the strength of surimi gel

圖6 谷氨酰胺轉氨酶添加量與蛋清蛋白添加量對魚糜凝膠強度的三維曲面圖Fig.6 Three-dimensional curve of the addition of glutamine aminotransferase and egg white protein on the strength of surimi gel

進一步用 Design-Expert 8.05 軟件對回歸模型進行典型性分析，根據軟件得出優化結果，經優化后，為使復合魚糜凝膠強度達到最大，各因素的最佳值為馬鈴薯淀粉添加量為16.15%，TGase 添加量為0.36%，蛋清蛋白添加量為5.56%，此時復合魚糜凝膠強度的理論最大值為2312.18 g·cm。根據優化后的添加量并結合實際選擇馬鈴薯淀粉添加量為16%，TGase 添加量為0.4%，蛋清蛋白添加量為6%，分別進行三組驗證性試驗，測得復合魚糜凝膠強度為2330.60 g·cm，相對于理論預測值誤差較小，說明建立的該模型的可行性高，可以相對真實地反映出各因素對復合魚糜凝膠性能的影響，具有實際應用生產的價值。

2.5 復合魚糜質構特性的測定

將優化工藝組與普通工藝組復合魚糜分別進行TPA 試驗，其質構特性參數由表4 所示。

由表4 可知，優化工藝組的硬度較普通工藝組硬度值下降了9%，咀嚼性較普通工藝組提高了57%，粘結性較普通工藝組提高了19%，凝膠強度值為破斷力與破斷距離的乘積，即優化工藝組的凝膠強度較普通工藝組提高了41%。優化工藝組的硬度、咀嚼性、粘結性、破斷力與破斷距離均顯著高于普通工藝組（P<0.05），這與葉麗紅等[28]研究相似，優化工藝組添加了蛋清蛋白，蛋清蛋白降低了魚糜的硬度，對彈性無太大影響，并且優化后的復合魚糜質構品質得到了提升。

表4 優化工藝組與普通工藝組質構特性參數對比Table 4 Comparison of structure characteristics of optimized process group and blank control group

2.6 復合魚糜凝膠微觀結構的比較

利用掃描電鏡對復合魚糜優化工藝組和普通工藝組樣品進行比較研究，結果如圖7 所示，伴隨著外源添加物作用，復合魚糜凝膠微觀結構發生明顯變化，添加外源添加物的優化工藝組的魚糜凝膠形成較為致密的網狀結構，凝膠孔洞較小，表面較為平整[29]，這可能與外源添加物中優化的蛋清蛋白濃度，能夠與蛋白質相互作用，改變凝膠強度有關，或者與馬鈴薯淀粉和TGase的添加量有關，兩者結合能夠捕獲魚糜中更多的游離水，降低其水分的流失，有助于復合魚糜凝膠形成致密的凝膠網狀結構[30?32]。而普通工藝組的魚糜凝膠則網絡疏松并存在較大的孔隙，且表面凹凸不平，也驗證了添加物的作用。

圖7 復合魚糜凝膠微觀結構對比Fig.7 Microscopic comparison of composite surimi gel

3 結論

以鰱魚與鱈魚制備復合魚糜，選擇外源添加物馬鈴薯淀粉、TGase 以及蛋清蛋白三種，通過響應面試驗優化復合魚糜凝膠性能，馬鈴薯淀粉添加量為16%，谷氨酰胺轉氨酶（TGase）添加量為0.4%，蛋清蛋白添加量為6.0%，復合魚糜凝膠強度最大。根據此配方（優化工藝組）所得復合魚糜質構特性參數中的咀嚼性、粘結性、破斷力與破斷距離均顯著高于未添加外源物普通工藝組（P<0.05），同時優化工藝組的復合魚糜的掃描電鏡圖顯示其凝膠結構網狀結構較為致密，凝膠孔洞較小。根據此配方添加外源添加物有助于改善復合魚糜凝膠特性，可以制備出品質優良的魚糜凝膠制品，并為進一步研究復合魚糜的凝膠機理奠定了良好的基礎。