超聲波輔助雙水相提取枇杷花總黃酮工藝優化及其抗氧化性

楊子敬，饒桂維, ，王 磊

（1.浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江杭州 310015；2.杭州師范大學錢江學院理工分院，浙江杭州 310015）

枇杷（EriobotryaLindl.）為薔薇科蘋果亞科常綠小喬木[1]，是一種具有藥用價值的小型果樹，2014 年批準成為新食品原料，藥食兼用[2]。近年來，枇杷花的價值越來越受到人們重視，對其研究不斷深入，枇杷花中主要成分為三萜類、黃酮類和揮發油等[3]，這些成分具有止咳、化痰、抗炎、降血糖、抗氧化、抗腫瘤[4?10]等藥理作用，但是在商業種植中，果農們通過疏花來提高枇杷果的品質與價值[10?11]，導致大量枇杷花被浪費[12]。本文將對枇杷花中的黃酮類物質的提取工藝進行研究并優化，目的是更好地開發利用枇杷花資源，為枇杷花后期的研究提供一定的理論基礎。

目前，枇杷花總黃酮的提取方法主要有水提法[13]、超聲波輔助法[14]、酶解結合超聲波法[15?16]，但提取液雜質過多、耗能較大無法實現工業化生產。大孔樹脂吸附[17]也有用于提取枇杷花總黃酮，但是此方法有機殘留物高、預處理難度大。雙水相是一種新興技術，它結合了從天然資源中分離、濃縮和部分純化目標化合物的功能[18]，被廣泛應用于黃酮的提取與分離[19]。張敏娜等[20]通過比較得出采用雙水相提取法提取月季花總黃酮的提取率更高，方法更加簡便。

本實驗以枇杷花為原料，對雙水相體系進行篩選，使用PEG400/硫酸銨雙水相體系分離枇杷花中的黃酮，在單因素的實驗結果的基礎上，通過Box-Behnken 響應面法確定最佳提取工藝，為工業上快速高效提取枇杷花總黃酮提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷花 來自電商購買；蘆丁 上海綠源生物科技有限公司；實驗所用試劑 均為國產分析純；水超純水。

DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；FW80 高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；ME204E 電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ臺式高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；L6S 紫外可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將枇杷花去除枝干，烘干，粉碎過200 目篩后放入保鮮袋，于干燥皿中保存。

1.2.2 標準溶液的制備與標準曲線的繪制 總黃酮的測定以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[21]，以蘆丁濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得到蘆丁濃度ρ 和吸光度值A的標準曲線線性回歸方程為A=0.0088ρ?0.0091，決定系數R2=0.9996，說明在2.065～103.250 mg/L 范圍內，溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關系。

1.2.3 構建雙水相體系 參考文獻[22?27]的雙水相體系組成，分別配制24%乙醇/18%硫酸銨，41.8%乙醇/22%磷酸氫二鉀，40%乙腈/25%磷酸氫二鉀，31%丙酮/23%硫酸銨，70%丙酮/24%磷酸氫二鉀，26% PEG400/20%硫酸銨的雙水相體系。

1.2.4 枇杷花總黃酮提取 固定體系質量為10 g，在15 mL 離心管中構建不同的雙水相體系，加入質量分數為0.5%的枇杷花粉末，加入超純水直至體系質量為10 g，將離心管置于超聲清洗器中超聲，固定時間為40 min，功率200 W，然后用離心機將其離心，7000 r/min 離心10 min 后取出，靜置直至上下相體積不再變化，記錄上相體積并移取0.2 mL，按照

1.2.2 的方法將其處理并測量其吸光度，再根據線性方程計算總黃酮濃度。

1.2.5 單因素實驗 分別考察超聲時間、枇杷花、PEG400 和硫酸銨的質量分數對總黃酮得率的影響。

1.2.5.1 超聲時間對總黃酮得率的影響 固定體系質量為10 g，在離心管中加入質量分數為0.5%的枇杷花粉，加入質量分數為26%的PEG400，加入質量分數為20%的硫酸銨，剩余質量由蒸餾水補充，再對其進行超聲，時間分別為20、30、40、50、60 min?？疾觳煌某晻r間對總黃酮得率的影響。

1.2.5.2 枇杷花質量分數對總黃酮得率的影響 固定超聲時間為上述實驗的最優值，其他條件不變，分別加入質量分數為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的枇杷花粉，考察不同質量分數的枇杷花對總黃酮得率的影響。

1.2.5.3 PEG400 質量分數對總黃酮得率的影響 固定超聲時間、枇杷花質量分數為上述實驗的最優值，其他條件不變，分別加入質量分數為24%、26%、28%、30%、32%的PEG400，考察不同質量分數的PEG400 對總黃酮得率的影響。

1.2.5.4 硫酸銨質量分數對總黃酮得率的影響 固定超聲時間、枇杷花質量分數、PEG400 質量分數為上述實驗最優值，分別加入質量分數為14%、16%、18%、20%、22%的硫酸銨，考察不同質量分數的硫酸銨對總黃酮得率的影響。

1.2.6 響應面試驗優化試驗設計 根據單因素實驗結果，選取影響總黃酮得率較大的超聲時間，枇杷花、PEG400 和硫酸銨質量分數作為自變量，以總黃酮得率為響應值，利用軟件Design-Expert 11 中Box-Behnken 試驗原理，設計4 因素3 水平的優化試驗。響應面試驗因素水平表如表1 所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.7 枇杷花總黃酮提取及得率計算 按照1.2.4的方法提取黃酮，取少量離心后的總黃酮提取液，按

1.2.2 的方法處理并測量粗提液的黃酮濃度，再按照下式計算枇杷花總黃酮得率。

式中：c：表示根據吸光度計算出的溶液質量濃度，mg/L；D：表示稀釋倍數；V：表示上相溶液體積，mL；m：表示枇杷花粉加入的質量，mg；10?3表示單位轉換。

1.2.8 枇杷花總黃酮抗氧化性研究

1.2.8.1 抗過氧化氫損傷的測定 在總黃酮提取液中分別加入0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的過氧化氫，待體系穩定后，測定其吸光度[28]。

1.2.8.2 羥基自由基清除率的測定 結合文獻[29]的方法，測定枇杷花總黃酮提取液對羥自由基的清除率。配制枇杷花總黃酮濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，取1.5 mL 樣品溶液,分別加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL 蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，再置于510 nm 波長處測定其吸光度,以蒸餾水作空白參比，同時以VC作陽性對照。再按照下式計算羥自由基清除率。

式中：A0為空白對照吸光度；A2為樣品溶液吸光度(加H2O2)；A1為樣品溶液吸光度(不加H2O2)。

1.2.8.3 還原力的測定 還原力的測定采用普魯士蘭法并參照Oyaizu 等[30]的方法，配制枇杷花總黃酮濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，取1.0 mL溶液加入試管，加入0.2 mol/mL、pH 為6.6的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL 和0.3%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，置于50 ℃水浴條件下反應20 min，再加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，于7000 r/min 條件下離心10 min，取上清液3.0 mL，加入0.3%三氯化鐵溶液0.5 mL，搖勻靜置10 min，定容至10 mL。以蒸餾水代替三氯化鐵，在相同條件下配制空白溶液，于700 nm 處測定吸光度,每個濃度平行做3 次，以蒸餾水作為參比。根據下式計算枇杷花總黃酮還原力。

還原力=A0?A1

式中：A0：樣品吸光度；A1：空白溶液吸光度。

1.3 數據處理

利用Design-Expert 11 進行響應面分析，利用SPSS 24 統計軟件、Microsoft Excel 2016 進行數據方差顯著性處理和分析，所有實驗均重復三次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 雙水相體系的選擇

不同雙水相體系對枇杷花總黃酮的得率結果如圖1 所示。

由圖1 可知，PEG400/硫酸銨體系的得率高于其他體系提取枇杷花中總黃酮的得率，得出采用PEG400/硫酸銨體系提取枇杷花總黃酮的效果最佳，故本實驗采用PEG400/硫酸銨體系。

圖1 雙水相體系的選擇Fig.1 Choice of two-phase system

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲時間對總黃酮得率的影響 由圖2 可知，隨著超聲時間的增加，枇杷花總黃酮得率呈現先上升后下降的趨勢，在超聲時間為40 min 時，得率達到最大值，為22.62%。超聲時間越長，細胞破碎的越完全，但繼續延長超聲時間時，超聲波使某些黃酮類成分發生氧化、降解或縮合等反應而被破壞,使含量有所下降[31]，因此選擇超聲時間為40 min 為宜。

圖2 超聲時間對得率的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on extraction rate

2.2.2 枇杷花質量分數對總黃酮得率的影響 由圖3可知，隨著枇杷花質量分數的增大，枇杷花總黃酮得率呈現先上升后下降的趨勢，在枇杷花質量分數為0.2%時，得率達到最大值，為25.39%。這主要是因為當上相尚未飽和時，增加枇杷花的量，得率增加，當繼續加入枇杷花時，大量枇杷花導致枇杷花總黃酮提取不完全，得率下降。綜合考慮成本和提取率這兩方面因素，故選擇枇杷花質量分數為0.2%。

圖3 枇杷花質量分數對得率的影響Fig.3 Effect of loquat flower mass fraction on extraction rate

2.2.3 PEG400 質量分數對總黃酮得率的影響 由圖4 可知，隨著PEG400 質量分數增大，枇杷花總黃酮得率呈現先上升后下降的趨勢，在PEG400 質量分數為28%時，得率達到最大值，為25.70%。主要是由于上相中PEG400 質量分數增加，上相水合能力增強，使得上相體積增大，疏水性增加，利于疏水性的枇杷花總黃酮在上相中富集，當繼續增加PEG400 質量分數時，雙水相體系粘度增大，上相溶液的空間位阻增加，不利于黃酮的富集[27,32]，使得率減少。因此，PEG400 質量分數為28%適宜。

圖4 PEG400 質量分數對得率的影響Fig.4 Effect of PEG400 mass fraction on extraction rate

2.2.4 硫酸銨質量分數對總黃酮得率的影響 由圖5可知，隨著硫酸銨質量分數增大，枇杷花總黃酮得率呈現先上升后下降的趨勢，在硫酸銨質量分數為18%時，得率達到最大值，為26.45%。這主要是因為隨著硫酸銨的增加，雙水相的析出作用增強，使總黃酮更多的富集在有機相[33]，所以總黃酮得率增加，當繼續增大硫酸銨質量分數時，雙水相體系極性增加，使得枇杷花總黃酮主要存在于下相，造成枇杷花總黃酮得率下降，不利于黃酮的提取，因此，選擇硫酸銨質量分數18%為適宜的條件。

圖5 硫酸銨質量分數對得率的影響Fig.5 Effect of (NH4)2SO4 mass fraction on extraction rate

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計方案及結果分析 采用Box-Behnken 響應面法對雙水相萃取枇杷花中的總黃酮的超聲時間，枇杷花質量分數，PEG400 質量分數和硫酸銨質量分數優化的結果如表2 所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiment

采用 Design-Expert 11 對枇杷花總黃酮得率進行數據分析得到各因素的回歸擬合方程如下：Y=26.03+2.68A+0.1892B+0.0242C+0.5742D?0.5AB+0.195AC?0.4675AD+0.5325BC?0.205BD+0.075CD?3.15A2?2.85B2?1.27C2?0.9388D2

經Design-Expert11 軟件ANOVA 法分析響應面二次多項式模型的顯著性，實驗方差結果分析如表3 所示，由表3 可知，模型中的A、D、AB、BC、A2、B2、C2、D2對枇杷花總黃酮得率的影響差異顯著（P<0.05），B、C、AD、AC、BD、CD 對枇杷花總黃酮得率的影響差異不顯著（P>0.05）?；貧w模型屬于顯著水平（P<0.05），失擬項差異不顯著（P=0.2458>0.05），試驗決定系數R2=0.9863 和校正測定系數R2adj=0.9726,低變異系數CV=1.93%。以上結果均表明模型擬合程度高，可靠性強，觀察值和實測值之間的相關性良好，可以對雙水相提取枇杷花中總黃酮的結果進行分析和預測。根據回歸方程和方差分析可知，各因素對枇杷花總黃酮得率的影響程度由大到小依次為A>D>B>C，即超聲時間>硫酸銨質量分數>枇杷花質量分數>PEG400 質量分數。

表3 響應面實驗結果及方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface experiment results

響應面法是通過分析自變量之間的相互作用以及自變量對響應值影響優化工藝的方法，是一種用于食品加工中高產和產品質量驗收的技術[34]。超聲時間、枇杷花質量分數、PEG400 質量分數、硫酸銨質量分數之間相互作用的響應面曲線圖如圖6 所示。通過響應面圖可直觀的看出各因素之間相互影響的顯著性，曲面越陡峭，說明影響越顯著[35]。由圖6 可以看出AC、AD、BD 和CD 之間的相互作用對得率的影響不大，響應面圖較為緩和；AB 和BC的相互作用對得率的影響大，響應面圖有不同程度的陡峭。

圖6 各因素對響應值影響的曲面圖Fig.6 Surface plot of the influence of various factors on the response value

2.3.2 最佳工藝條件的預測及驗證實驗 根據響應面模型預測雙水相提取枇杷花中總黃酮的實驗條件為：超聲時間為44.125 min，枇杷花質量分數為0.199%，PEG400 質量分數為28.092%，硫酸銨質量分數為18.412%，理論總黃酮得率為26.641%，為了驗證預測值的準確性，同時兼顧操作的方便性，將最佳工藝條件調整為：超聲時間為45 min，枇杷花質量分數為0.2%，PEG400 質量分數為28%，硫酸銨質量分數為18%，在此工藝條件下進行驗證實驗，重復實驗3 次，得到枇杷花總黃酮平均得率為26.96%，預測值與實驗值無顯著性差異，表明該模型適用于枇杷花總黃酮的提取。

2.4 枇杷花總黃酮的抗氧化性

2.4.1 抗過氧化氫損傷 如圖7 所示，隨著過氧化氫濃度的提高，總黃酮提取液的吸光度變化不大，說明枇杷花總黃酮對不同濃度過氧化氫的損傷具有良好的耐受力，體現了該黃酮有較強的抗氧化性。

圖7 不同濃度過氧化氫對黃酮提取液的影響Fig.7 The effect of different concentrations of hydrogen peroxide on flavonoid extract

2.4.2 羥自由基清除率 枇杷花提取液對羥自由基的清除能力如圖8 所示，隨著提取液濃度增大羥自由基的清除率增大。在濃度0.1～0.3 mg/mL 時，總黃酮提取液對羥自由基的清除率大于Vc，在濃度達到0.5 mg/mL 時，總黃酮提取液對羥自由基的清除率達到71.89%，Vc 在相同濃度下的清除率為76.34%?？傸S酮濃度在0.4 mg/mL 和0.5 mg/mL 之間不存在顯著差異（P>0.05）,說明提高總黃酮濃度，清除率無明顯差異?？傸S酮提取液清除·OH的IC50為0.297 mg/mL，Vc 清除·OH的IC50為0.315 mg/mL。通過比較兩者的IC50值，可知枇杷花總黃酮清除·OH的能力優于Vc。

圖8 枇杷花總黃酮和Vc的羥自由基清除率Fig.8 Scavenging rate of hydroxyl free radicals of loquat flower flavonoids and Vc

2.4.3 還原力 測定其吸光度的大小反映樣品還原能力的大小，吸光度越大則還原力越強。枇杷花總黃酮和Vc的還原力測定結果如圖9 所示，隨著濃度的增高，枇杷花總黃酮和Vc的還原力也在增大，Vc 增加的速度高于枇杷花總黃酮，濃度越大，Vc的還原力越優于枇杷花總黃酮的還原力。

圖9 枇杷花總黃酮和Vc的還原力Fig.9 The reducing power of loquat flower flavonoids and Vc

3 討論與結論

本文研究了不同雙水相體系對枇杷花總黃酮得率的影響，確定采用PEG400/硫酸銨體系來提取枇杷花總黃酮，對其提取工藝流程進行優化，最佳的工藝條件為：超聲時間為45 min，枇杷花質量分數為0.2%，PEG400 質量分數為28%，硫酸銨質量分數為18%，在此條件下提取得到枇杷花總黃酮的含量為269.6 mg/g。與黃瓊[14]、謝田偉[21]、鄭美瑜[36]采用的提取工藝所得到的含量相比，采用雙水相提取得到枇杷花總黃酮的含量更高。對采用此工藝得到的枇杷花總黃酮進行抗氧化性實驗，結果表明：此工藝得到的枇杷花總黃酮具有良好的抗氧化性。黃酮類化合物既可以作為食品添加劑延緩食物的氧化，也可以預防自由基引發的多種疾病，因此枇杷花在食品和醫藥的研制方面都有良好的應用前景。

利用雙水相提取黃酮，該方法具有操作簡便、條件溫和、設備簡單、成本低、效率高等優點，但本實驗中提取的黃酮存在于有機相中，下一步可對總黃酮提取液進行分離純化并對成分進行分析，更加深入研究枇杷花總黃酮的抗氧化功效。本實驗為枇杷花的深度利用提供了新的參考方法，但是如何將此工藝應用于工業化生產，提高枇杷花產業鏈的綜合效益是一個新的研究方向。