辣木葉茶4 種發酵方式不同發酵階段化學成分與品質變化及其相關性分析

郭剛軍，胡小靜，徐 榮，馬尚玄，張祖兵，何 銳，李海泉,

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪 666100；2.文山學院化學與工程學院，云南文山 663000）

辣木（Moringa oleiferaLam.）為辣木科辣木屬植物，屬小喬植物，常綠或半落葉，原產于印度，又稱為奇樹，鼓槌樹，廣泛種植在亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶和亞熱帶地區[1?2]。辣木富含蛋白質、碳水化合物、VA、葉酸、泛酸、鈣、鐵、硒等多種營養素，被稱為“營養大全”[3?4]，還含有類胡蘿卜素、酚類、黃酮類、植物甾醇、苷類、多糖、生物堿、有機酸類、細胞分裂素等多種功能成分[5?7]。辣木在國外有“奇跡樹”、“母親最好的朋友”和“天然藥柜”等美稱[4]。現代藥理學研究發現，辣木具有抗氧化、解痙、抗病毒、抗菌消炎、抗癌、降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抑制DNA 氧化損傷、調節腸道微生物、抗潰瘍等多種生物活性[8?10]。2012 年，我國衛生部第19 號公告批準辣木葉作為新食品原料，同年辣木被中國綠色食品發展中心認定為“國家首推綠色食品”[2]。

辣木茶是以辣木鮮葉和莖為原料，采用綠茶工藝加工制成的高檔養生保健茶，外形翠綠，茶性溫和，易沖耐泡，滋味滑口，湯色黃綠明亮，葉底柔軟完整[11]。固態發酵是指利用微生物在潮濕的沒有自由流動水的固體基質上生長代謝的技術，具有高效、經濟且產物產率較高的特點，在食品加工中被廣泛利用[12?13]。它通過產生一系列的酶類，發生氧化、聚合、縮合等復雜的酶促反應，產生生物活性物質，提高產品的營養與功能[14]。目前，有關辣木發酵方面的研究有張云娟等[15]采用毛霉對辣木葉粉進行了固態發酵，分析了其主要營養成分、相關酶活力及抗氧化活性的變化；石鴻輝等[14]利用黑曲霉、產骯假絲酵母、枯草芽胞桿菌為發酵菌種對辣木莖葉粉進行固態好氧發酵，分析了對其營養價值與抗氧化活性的影響；李倩等[16]應用植物乳桿菌S35 菌株對辣木葉提取液進行了液態發酵，研究了其發酵過程中pH、可溶性固形物、總酸、還原糖、黃酮、多酚、有機酸及清除DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的活性變化，而有關利用微生物固態發酵辣木葉茶的研究尚不多見。

本研究以自制辣木葉茶為原料，對其進行自然發酵、酵母發酵、根霉發酵與黑曲霉發酵，分析不同發酵階段樣的感官品質、化學成分及色澤指標變化，探尋它們之間的相關性，為辣木葉的深加工及開發利用提供一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木鮮葉 采自云南省熱帶作物科學研究所中國-古巴辣木科技合作實驗基地；酵母（Saccharomyce scerevisiae） 安琪酵母股份有限公司；根霉 廣西博白縣沙河鎮大石酒曲廠；黑曲霉（Aspergillus brasiliensis） 上海魯微科技有限公司；牛肉浸粉、蛋白胨、蘆丁、牛血清蛋白、葡聚糖、咖啡因等標準品 中國藥品生物制品檢定所；考馬斯亮藍G250 上海邁坤化工有限公司；硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉、濃磷酸、蒽酮、濃硫酸、堿式乙酸鉛、濃鹽酸、碳酸氫鈉、草酸等均為分析純 中國醫藥集團有限公司。

6CST-30 型茶葉殺青機、6CR-35 型茶葉揉捻機浙江上洋機械有限公司；BSC-400 型恒溫恒濕培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；MJ33 型快速水分測定儀 上海精科實驗儀器有限公司；SPX-250-ZZ 型生化培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；BGZ-240 型電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA1004 型分析天平 杭州匯爾儀器設備有限公司；UV754N 型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；HH-8 型數顯恒溫水浴鍋 上海和晟儀器科技有限公司；SC-80I 型色差計 北京京儀康光光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉茶原料的制備 采用殺青機將辣木葉鮮葉殺青至葉片失去光澤，葉色暗綠，葉質柔軟、萎卷，青草氣散失，顯露清香，再用揉捻機按照輕-重-輕與抖揉結合的原則反復揉捻30 min，然后在80 ℃電熱鼓風干燥箱中將其干燥至含水量4%～6%，冷卻，挑揀葉柄，制得辣木葉茶原料，備用[17]。

1.2.2 菌種的活化與培養

1.2.2.1 酵母菌 取10 g 果酒專用酵母加100 mL 濃度5%葡萄糖溶液，在溫度36 ℃的培養箱中活化0.5 h，培養液上層冒泡，表明酵母菌活力較好，然后添加4400 mL的無菌水稀釋，備用。

1.2.2.2 根霉菌 取麥麩添加根霉300 g 加400 mL無菌水浸泡12 h，每0.5 h 攪拌一次，用滅菌濾布過濾，加無菌水稀釋至4500 mL 備用。

1.2.2.3 黑曲霉 取1 g 黑曲霉凍干粉加入5 mL 營養肉湯培養基，在溫度33～36 ℃下培養30 h，加入5%葡萄糖1500 mL 培養28～30 h。然后取其中的300 mL 加4200 mL 無菌水稀釋，備用。

1.2.3 辣木葉茶的固態發酵 分別取5 kg 辣木葉茶4 份，分別噴灑4500 mL 無菌水、酵母培養液、根霉培養液與黑曲霉培養液進行自然發酵、酵母發酵、根霉發酵與黑曲霉發酵，翻勻，在溫度45 ℃、相對濕度85%恒溫恒濕條件下發酵16 d，每4 d 翻堆1 次并取樣，測定其化學成分含量與色澤指標，并進行感官評價[18]。

1.2.4 辣木葉茶及不同發酵階段樣的色澤測定 分別取3 g 辣木葉茶及不同發酵階段樣，加沸水150 mL，浸泡5 min，抽濾，制得茶湯，然后采用SC-80I 全自動色差計在10 °視場、D65 光源條件下，對茶湯的色差值進行測定。試驗采用的是Hunter Lab 色系統，此系統中，L*是明度變量，a*和b*是色品坐標，ΔL*，Δa*，Δb*均表示色差值，ΔE*表示總色差值。L*大表示偏白，L*小表示偏黑；a*大表示偏紅，a*小表示偏綠；b*大表示偏黃，b*小表示偏藍[19?20]。

1.2.5 辣木葉茶及不同發酵階段樣的感官評價 在光線充足、無異味的品評室內對辣木葉茶及不同發酵階段樣進行感官評價。評價方法：由6 名從事辣木葉加工的專業人員評出相應的得分，取平均值。評價指標參考GB/T 22111-2008《地理標志產品普洱茶》，包括：色澤（10 分）、凈度（10 分）、湯色（15 分）、香氣（30 分）、滋味（25 分）、葉底（10 分）[21?22]。

1.2.6 辣木葉茶及不同發酵階段樣化學成分的測定多酚、水浸出物含量測定參考文獻[23]，采用酒石酸鐵比色法、GB/T 8305-2013 進行；黃酮含量測定參考文獻[24]，采用三氯化鋁比色法進行；多糖含量測定參考文獻[25]，采用苯酚-硫酸比色法進行；可溶性蛋白含量測定參考文獻[26]，采用考馬斯亮藍比色法進行；咖啡堿含量測定參考文獻[27]，按GB/T 8312-2013 進行。

1.3 數據處理

數據采用SAS 9.2 軟件處理，應用方差分析與鄧肯氏法進行顯著性分析，以P<0.05 為差異具有統計學意義；采用皮爾森法進行相關性分析；運用REG過程進行多元線性回歸分析。實驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 辣木葉茶不同發酵階段樣的色澤分析

由表1 可知，辣木葉茶在自然發酵、酵母發酵、根霉發酵與黑曲霉發酵的不同階段，其色澤發生了明顯的變化。酵母發酵與根霉發酵茶樣的L*值隨翻堆次數的增加而降低，其均在四翻樣降到最低；自然發酵與黑曲霉發酵隨翻堆次數增加呈先降低后升高的趨勢，其均在三翻樣降到最低。不同方式發酵茶樣的L*值均低于辣木葉茶，表其湯色不如辣木葉茶明亮。成洲等[28]研究表明，茶湯的L*值與品質審評評分呈極顯著負相關，這是與本研究結果是一致的。

表1 辣木葉茶不同發酵階段樣色澤分析Table 1 Color analysis of Moringa oleifera leaf tea samples in different fermentation stages

自然發酵與黑曲霉發酵辣木葉茶翻堆樣△E*值隨翻堆次數增加而先增加后降低，酵母發酵逐漸上升。四種發酵方式茶樣的a*值與△a*均隨翻堆次數的增加而上升，自然發酵、酵母發酵與根霉發酵茶樣的b*值與△b*值總體隨翻堆次數增加而上升，黑曲霉發酵隨翻堆次數的增加呈先降低后升高的趨勢。四種發酵方式的四翻樣中，黑曲霉發酵樣的△E*值、a*值與△a*值均最大，分別為36.42、15.66 與12.20。結合辣木葉茶不同發酵階段樣感官品評與化學成分變化結果，這表明本研究隨著發酵的進行，辣木葉茶中的紅褐色色素類物質被大量生成，其含量大幅增加，形成辣木葉發酵茶特有的品質特征，推測辣木紅褐色素的形成是在微生物分泌酶、“呼吸熱”以及渥堆濕熱作用下，通過氧化多酚、黃酮等酚類物質，并偶聯、縮合、聚合蛋白質、多糖、咖啡堿等物質的方式形成，是辣木葉茶發酵樣湯色的主要呈色物質[29?30]。

2.2 辣木葉茶不同發酵階段樣感官品質分析

由表2 可知，不同方式發酵的辣木葉茶在不同發酵階段，其色澤、凈度、湯色、香氣、滋味與葉底等感官指標發生了明顯變化。其中，自然發酵與酵母發酵干茶樣外觀色澤由最初的墨綠色變為灰綠色，根霉發酵與黑曲霉發酵茶變為褐色。各種發酵方式干茶樣的凈度與湯色隨翻堆次數的增加而提高，其中黑曲霉發酵四翻樣最好。與辣木葉茶相比，經發酵后，自然發酵與黑曲霉發酵茶樣的香氣有了較大提升，酵母發酵與根霉發酵茶樣后期也有所提升，但前期較差。其中，黑曲霉發酵四翻茶樣的香氣品質陳香純正，感官得分最高。不同方式發酵茶樣的滋味品質均隨翻堆次數增加而有所提升，自然發酵、酵母發酵與黑曲霉發酵茶樣開始階段為酸澀或苦澀，發酵到后期轉變為醇和回甘，其中黑曲霉發酵茶樣的滋味品質醇和回甘，得分最高，根霉發酵后茶葉雖品質也有提升，但到后期還是有微酸味。各茶樣的葉底品質隨翻堆次數的增加而提高，發酵到后期，自然發酵與根霉發酵茶樣轉變為黃褐色，酵母發酵與黑曲霉發酵轉變為黑褐色，但總體比辣木葉茶略差。隨著翻堆次數的增加，自然發酵、根霉發酵與黑曲霉發酵茶樣的綜合感官品質逐漸提升，酵母發酵呈先上升后下降的趨勢，所有茶樣中，黑曲霉發酵四翻樣感官品質最好，綜合得分最高。

表2 辣木葉茶不同發酵階段樣感官評價結果Table 2 Sensory evaluation of Moringa oleifera leaf tea samples in different fermentation stages

2.3 辣木葉茶不同發酵階段化學成分變化分析

由圖1 可知，自然發酵、酵母發酵、根霉發酵與黑曲霉發酵的辣木葉茶在不同的發酵階段，化學成分發生了大幅度變化，形成了辣木葉發酵茶特有的品質特征。

圖1 辣木葉茶不同發酵階段樣化學成分含量變化Fig.1 Changes of contents of chemical constituents of Moringa oleifera leaf tea samples in different fermentation stages

在不同的發酵階段，辣木葉茶不同方式發酵樣多酚含量總體隨翻堆次數的增加而降低，其中酵母發酵降低最多，其四翻樣含量最低，僅為8.59 mg/g，與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），其次為黑曲霉發酵，其三翻樣含量最低，為13.07 mg/g，與四翻樣無顯著性差異（P>0.05），根霉發酵下降最慢。

辣木黃酮含量隨翻堆次數的增加而降低，其中酵母發酵下降最多，其四翻樣含量最低，為7.27 mg/g，與三翻樣無顯著性差異（P>0.05），其次為黑曲霉發酵，其四翻樣含量最低，為10.99 mg/g，與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），根霉發酵下降最少，發酵程度最低。

辣木可溶性蛋白含量總體隨翻堆次數的增加而升高，其中酵母發酵增加相對較多，其四翻樣含量最高，為19.63 mg/g，與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），其次為黑曲霉發酵，其四翻樣含量最高，為16.46 mg/g，與一翻、三翻樣無顯著性差異（P>0.05），根霉發酵增加最少，發酵程度最低。

辣木多糖含量總體隨翻堆次數的增加而降低，其中酵母發酵降低最多，其三翻樣含量最低，為11.79 mg/g，與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），其次是自然發酵，其四翻樣含量最低，為23.05 mg/g，與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），根霉發酵下降最少，發酵程度最低。

辣木咖啡堿含量總體隨翻堆次數的增加呈先增加后減少的趨勢，其中自然發酵增加相對較多，其二翻樣含量最高，為3.41 mg/g，與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），其次為黑曲霉發酵，其二翻樣含量最高，為3.11 mg/g，與其三翻樣無顯著性差異（P>0.05），根霉發酵增加較少，發酵程度較低。

辣木葉茶不同方式發酵樣水浸出物含量隨翻堆次數增加呈先減少后增加的趨勢，均為發酵到第三翻時含量最低，其中酵母發酵下降相對較多，其三翻樣含量為239.20 mg/g，其次是自然發酵，其三翻樣含量為312.10 mg/g，均與辣木葉茶及其他翻堆樣存在顯著性差異（P<0.05），根霉發酵下降最少，發酵程度最低。

何國藩等[31]從普洱茶渥堆葉片組織的顯微結構變化證明，微生物分泌的多種酶類及代謝產生的熱量對茶葉內含物的氧化還原反應以及品質起到重要的作用。黑茶渥堆發酵過程中，茶多酚、兒茶素及氨基酸茶黃素、茶紅素的含量都呈下降趨勢，茶褐素呈上升趨勢，而可溶性糖、水浸出物、咖啡堿含量有升有降或變化不明顯[32]。張云娟等[15]采用毛霉發酵辣木葉粉的過程中，其所含有的可溶性蛋白、可溶性多糖、多酚與游離氨基酸均發生了明顯變化。辣木葉茶微生物渥堆發酵的機理尚有待進一步研究，推測是在微生物分泌的酶類及濕熱作用下，其所含有的特征化學物質發生了一系列復雜劇烈的生物轉化反應，從而形成了辣木葉發酵茶湯色紅褐明亮與滋味醇和、回甘的品質特征。

2.4 辣木葉茶不同發酵階段樣化學成分及總色差的相關性研究

2.4.1 辣木葉茶不同發酵階段樣化學成分及總色差的相關性分析 由表3 可知，辣木葉茶不同發酵階段樣的水浸出物含量與多酚、黃酮和多糖的含量呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數分別為0.8821、0.7598 與0.7240。總色差△E*的大小體現的是茶色素的含量，與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數為0.6885，與咖啡堿含量呈顯著正相關（P<0.05），相關系數為0.5825，與多酚、黃酮含量呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數分別為?0.5160 與?0.7928。多糖含量與多酚、黃酮含量呈顯著正相關（P<0.05），相關系數分別為0.6017 與0.4957。可溶性蛋白含量與黃酮含量呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數為?0.6489。黃酮含量與多酚含量呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數為0.8716。

表3 各項指標的相關系數及其顯著性檢驗結果Table 3 Correlation coefficients of indexes and significant test results

2.4.2 辣木葉茶不同發酵階段樣水浸出物與化學成分及總色差多元回歸分析 茶或代用茶的水浸出物含量是評價茶品質的綜合性指標，一般來說水浸出物含量越高，品質越好[33]。為找出影響辣木葉茶不同發酵階段樣水浸出物含量變化的主要因素，以水浸出物含量（Y）為因變量，辣木多酚（X1）、黃酮（X2）、可溶性蛋白（X3）、多糖（X4）、咖啡堿（X5）含量及總色差△E*（X6）為自變量進行逐步回歸分析，建立多元線性回歸方程，結果見表4、表5。

表4 模型方差分析結果Table 4 Results of model variance analysis

表5 多元回歸分析結果Table 5 Results of multiple regression analysis

由表4 可知，通過方差分析，該模型的F值=31.43，P<0.0001，決定系數R2為0.9419，說明其有統計學意義，效果理想。由表5 可知，辣木葉茶不同發酵階段樣的水浸出物含量與辣木多酚、黃酮、可溶性蛋白、多糖、咖啡堿含量及總色差之間的線性關系經逐步回歸分析后，辣木黃酮、咖啡堿及總色差△E*變量均被剔除，辣木多酚變量對水浸出物的回歸達到極顯著水平（P<0.01），可溶性蛋白、多糖變量達到顯著性水平（P<0.05），而被引入回歸方程。辣木多酚、可溶性蛋白與多糖這三個指標的標準回歸系數分別0.8153、0.2524 與0.3018，表明其對水浸出物含量作用的大小順序依次為多酚>多糖>可溶性蛋白。得到的回歸方程為：Y=15.8337+0.6793X1+0.2360X3+0.0897X4，其可以把辣木葉發酵茶加工過程中水浸出物含量與多酚、可溶性蛋白、多糖含量之間的關系量化，為辣木葉茶發酵過程中的品質控制提供理論參考。

3 結論

在不同的發酵階段，自然發酵、酵母發酵、根霉發酵與黑曲霉發酵4 種方式辣木葉茶不同階段樣的化學成分與品質發生了明顯的變化，其評估茶湯色澤指標的L*值總體隨翻堆次數的增加而下降，△E*值、a*值、b*值指標隨翻堆次數的增加而有所上升，其中黑曲霉發酵各指標值變化最大；茶樣色澤、凈度與茶湯湯色、香氣、滋味、葉底感官指標的總得分呈上升趨勢，其中黑曲霉發酵總得分最高，效果最好；化學成分中的可溶性蛋白、咖啡堿含量有所增加，多酚、黃酮、多糖、水浸出物含量有所下降。辣木葉茶不同發酵階段樣的水浸出物含量與多酚、可溶性蛋白與多糖的含量呈極顯著正相關（P<0.01）。本研究結果可為辣木葉茶發酵過程中的化學成分變化與品質控制提供一定理論參考，且實驗表明發酵所形成的紅褐色素類物質是辣木葉發酵茶的特征物質與呈色成分，但其具體的化學組成尚不清楚，下一步可對其進行系統分離純化，研究其具體色素成分、測定方法與功能活性，為辣木葉這一資源的深度開發提供一定的技術依據。