液相法測定米香型白酒發酵液中18 種有機酸

郝俊光，柯 鋒，梁振榮，張 龍，戴梓茹, ，施紹穎，羅 丹，李官連

（1.欽州市食品風味分析與調控重點實驗室，北部灣大學食品工程學院，廣西欽州 535011；2.廣西天龍泉酒業有限公司，廣西河池 546400）

白酒有機酸按物理性質可以分成三類：C1～C6的揮發性脂肪酸、C7～C22的不揮發脂肪酸和熱不穩定酸（如琥珀酸、草酸、檸檬酸等多元酸）[1]。有機酸的組成和含量不僅影響白酒發酵過程微生物的生長與繁殖[2?4]，也影響酯類香氣物質的合成[4?5]。作為成品酒的重要呈味物質，有機酸還能起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用，其含量高低及相互比例直接影響著白酒的風味、質量[4?5]以及飲后舒適度[6?7]。

米香型白酒是中國四大基本白酒香型之一，以大米為原料、小曲為糖化發酵劑，經米飯固態培菌糖化、加水半液態發酵以及蒸餾而成[8]。隨著產業設備技術的發展以及白酒消費習慣的改變，以效率提升、風味優化為目的的米香型白酒的現代化和低度化生產成為歷史的必然[9?11]。目前，米香型白酒在市場上呈現風味多樣化，不同工廠的風味物質分布差異非常大[12]。關于米香型白酒有機酸的產生與分布的報道較少[13?14]，有待進一步細化研究。有機酸的定量一直是白酒風味物質研究的重點和熱點之一。目前，可以檢測白酒有機酸的方法有氣相法[15]、氣質法[16?17]、離子色譜法[18?20]、液質法[21]、液相法[22?24]等。氣相直接檢測技術適用于揮發性高的脂肪酸檢測[15]，但不適合熱不穩定酸（如乳酸）的檢測。氣相（質）衍生技術可以實現乳酸等熱不穩定酸的檢測，但操作繁瑣[16?17]。陰離子交換色譜法可實現白酒短、中鏈揮發酸和包括乳酸在內的難揮發酸的同時檢測，但儀器專用、購置成本高[18?20]。高分辨液相質譜可實現白酒中多種微量有機酸的檢測，但儀器和檢測成本昂貴[21]。液相色譜法成本相對較低，在白酒有機酸的檢測中應用較多，已實現了對乙酸、乳酸及其它熱不穩定酸的檢測[22?24]，但尚未見其對白酒短鏈脂肪酸檢測的報道[25?26]。

鑒于短鏈脂肪酸的重要性[6?7]，以及液相色譜因價格比離子交換色譜、氣相質譜、液相質譜便宜而在工廠中更為普及的事實，本研究將利用液相色譜開發一種能實現短鏈脂肪酸和熱不穩定脂肪酸同時檢測的技術，并對米香型白酒的發酵過程進行跟蹤，以期為米香型白酒生產提供有機酸品控的實用性手段，明確其發酵過程中不同有機酸的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米香型白酒發酵醪、小曲（糖化力34 g/100 g，發酵力37%vol） 廣西天龍泉酒業有限公司；晚稻大米廣西河池市售；葡萄糖酸溶液（純度51%）、甲醇、磷酸、乙酸、KH2PO4、草酸、L-蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、L-酒石酸、奎尼酸、甲酸、丙酮酸、琥珀酸、異戊酸、抗壞血酸、L-乳酸 色譜純，上海麥克林生化科技有限公司。

Alliance 高效液相色譜儀（配備2695HPLC 分離單元、2996PDA 檢測器、Empower 工作站） 美國Waters 儀器公司；DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；INNOVA 43R 落地式低溫搖床 上海巴玖實業有限公司；H1850 高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ME204E 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cascada I 實驗室超純水系統 美國Pall 公司；0.22 μm SLGP 033RB針頭濾膜 美國Millipore 公司；PHS-3E 雷磁pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；白酒生產中試線（配備100 kg 蒸飯鍋一套、300 L 控溫發酵罐5 個） 廣西天龍泉酒業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 定性標準溶液的配制 稱取適量化合物，配制成草酸100 mg/L、L-酒石酸800 mg/L、葡萄糖酸5000 mg/L、奎尼酸150 mg/L、甲酸200 mg/L、丙酮酸40 mg/L、L-蘋果酸400 mg/L、抗壞血酸60 mg/L、L-乳酸400 mg/L、乙酸5000 mg/L、檸檬酸200 mg/L、富馬酸6 mg/L、琥珀酸400 mg/L、丙酸400 mg/L、異丁酸400 mg/L、正丁酸400 mg/L、戊酸400 mg/L、異戊酸400 mg/L的單標，用于不同有機酸保留時間和峰形的確定。上述單標溶液等體積混合后用于色譜條件的優化，不同色譜條件下色譜峰的辨識基于峰形、強度和出峰順序。

1.2.2 色譜的基本操作條件 色譜柱：Waters Atlantis?T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：甲醇溶液；流動相B：KH2PO4緩沖液（0.02 mol/L，pH2.6）；洗脫方式：線性梯度；流速變化方式：恒速；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm。

1.2.3 色譜條件的優化和有機酸的定性 在檢測波長、流動相pH 固定的前提下，分別進行了線性洗脫梯度一（見表1），流速分別是0.43、0.40、0.37 mL/min的比對實驗A、B、C，確定出適合的流速。進而在最佳流速條件下，進行梯度二、三（見表1）的比較實驗E、F，以確定分離度高且檢測周期短的優化洗脫梯度。在優化的色譜條件下，測定每個有機酸的保留時間，完成有機酸的定性。

表1 優化過程所采用的三種洗脫梯度Table 1 The comparison of the three eluent gradients adopted in the optimization process

分離度的計算公式為[27]：Rs=2（tR2?tR1）/（Y1+Y2）

式中，Rs是兩個相鄰組分的分離度；tR1、tR2和Y1、Y2分別為兩組分的保留時間和峰寬。

1.2.4 混合標準儲備液的配制 稱取各種標準品適量，用KH2PO4緩沖液溶解并定容至100 mL 容量瓶，得到濃度為草酸500 mg/L、L-酒石酸4000 mg/L、葡萄糖酸25000 mg/L、奎尼酸750 mg/L、甲酸100 mg/L、丙酮酸200 mg/L、L-蘋果酸2000 mg/L、抗壞血酸300 mg/L、L-乳酸2000 mg/L、乙酸20000 mg/L、檸檬酸1000 mg/L、富馬酸30 mg/L、琥珀酸2000 mg/L、丙酸2000 mg/L、異丁酸2000 mg/L、正丁酸2000 mg/L、戊酸2000 mg/L、異戊酸2000 mg/L的混合標準儲備液，4 ℃保存。

1.2.5 標準曲線的建立與樣品定量 分別吸取2.5、5、10、20、40 mL 混合標準儲備液于100 mL 容量瓶中，用KH2PO4緩沖液定容，得到5 個混合標樣的濃度梯度。在優化的條件下對濃度梯度1～5 由低到高進行檢測，將峰面積（y）和濃度（x）進行強制過原點的線性擬合，建立標準曲線。將液相測出樣品的不同有機酸的峰面積帶入各自的標準曲線，即可實現樣品中有機酸定量。

1.2.6 定量方法的方法學評估 把最低濃度標準溶液逐步稀釋檢測，取信噪比等于S/N 3 和10 時對應分析物的濃度作為檢出限和定量限。向米香型白酒9 d 發酵液的5 倍稀釋液中加入等體積的梯度4 混合標準溶液，平行測定6 次，計算出相應組分的加標回收率和相對標準偏差。

1.2.7 米香型白酒的發酵和取樣 米香型白酒的發酵工藝路線為：大米→淘洗→蒸飯→冷卻→加曲糖化→加水入罐→發酵。操作要點為：

a、蒸飯

將100 kg 大米置于不銹鋼桶中浸泡2 h，倒入蒸飯機中預煮45 min，然后開蓋邊攪拌邊加入適量的水，進行第2 次蒸煮33 min，再次開蓋攪拌加水（米飯水分控制在64%～66%），進行第3 次蒸煮25 min，出鍋攤晾，降溫至33 ℃，下曲1 kg，轉入糖化槽進行糖化。

b、糖化

室溫糖化24 h，期間每8 h 翻拌一次，加入重量比120%的水混合均勻，用泵抽入發酵罐中進行發酵。

c、發酵

發酵12 d，前6 d 發酵溫度控制在27～29 ℃，此為主發酵期，后6 d 控制在21～22 ℃，此為后發酵期。

d、取樣與檢測

共進行3 次發酵實驗，分別取每批實驗的第0、3、6、9、12 d的醪液進行有機酸、總酸的檢測；分別取每批實驗的第0、1、2、3、6、9、12 d的樣品進行有酒精度、pH的檢測。

1.2.8 有機酸的檢測 將所取樣品以8000 r/min 離心15 min，然后經0.22 μm 針頭微孔濾膜過濾至樣品瓶。在優化的色譜條件下檢測，進樣量：10 μL，外標法定量，每個樣品檢測三次。

1.2.9 酒精度、總酸、pH的檢測 參照GB/T 10345-2007《白酒分析方法》的密度瓶法測定酒精度、電位滴定法測定總酸、pH 計法測定pH，結果分別以酒精的體積占比（% V/V）、以乙酸計的濃度（g/L）、pH 值表示，每個樣品檢測三次。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件對數據進行處理，數據以三次實驗的九個檢測數據的平均值±標準偏差形式表示。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

本研究是在利用Waters Atlantis?T3 色譜柱測定毛葡萄發酵液中有機酸的基礎上增加6 種短鏈脂肪酸的檢測方法開發，其檢測波長210 nm、柱溫箱溫度30 ℃、流動相為“甲醇和KH2PO4緩沖液（0.02 mol/L，pH2.6）”、進樣量10 μL[28]，被直接沿用。由于短鏈脂肪酸的出峰較晚，需采用梯度洗脫縮短檢測周期。

首先采用梯度一（見表1）、流速0.43 mL/min 進行標樣分離（結果見圖1），發現除奎尼酸（峰4）與甲酸（峰5），異丁酸（峰15）與正丁酸（峰16）分離度略差外，其它有機酸均能有效分離。降低流速可以提高分離度，為此進行了0.40、0.37 mL/min 分離效果的比對實驗，結果見圖2。為提高圖片的可視性，圖2只顯示了6～34 min 時間段的圖譜。經比對計算，流速0.43、0.40、0.37 mL/min 對應的奎尼酸與甲酸分離度分別達到1.26、1.51、1.61。鑒于流速0.40 mL/min條件下二者達到了完全分離（分離度≥1.50）[27]，且較0.37 mL/min的檢測周期短，故確定0.40 mL/min為優化的洗脫流速。

圖1 18 種有機酸標樣在流速0.43 mL/min的HPLC 色譜圖Fig.1 Chromatograms of 18 organic acid standards at eluent velocity of 0.43 mL/min

圖2 18 種有機酸標樣在不同流速下的HPLC 色譜圖Fig.2 Chromatograms of 18 organic acid standards at three eluent velocities

在梯度一、流速0.40 mL/min的洗脫條件下，異丁酸與正丁酸的分離度已達到1.39，能較好地實現定性、定量。考慮到最后出峰的異戊酸在此條件下保留時間已達到63 min，且流動相重新回到下一個測定起始狀態需要較長的平衡時間，不再進行降低洗脫強度提高分離度的實驗，而是進行為縮短檢測周期而降低洗脫強度的梯度二、梯度三比對試驗。洗脫液中有機相甲醇比例增加時，會減弱有機酸疏水端與固定相的作用，縮短保留時間[26]，但流動相甲醇比例過高、梯度改變速率過快時會導致磷酸鹽析出而造成色譜柱堵塞[26]，因而梯度洗脫終點設為42%且梯度變化較緩慢。三種梯度條件下，四種酸的分離情況見圖3。梯度一、二、三所對應的異丁酸與正丁酸的分離度分別為1.39、1.13、1.28，異戊酸的保留時間分別為63.02、61.73、62.69 min，可以看出梯度改變對檢測周期縮短作用不大，卻會明顯降低分離效果，因而仍選取梯度一作為優化的洗脫梯度。

圖3 18 種有機酸標樣在三個洗脫梯度下的HPLC 色譜圖Fig.3 Chromatograms of 18 organic acid standards at three eluent gradients

2.2 有機酸的定性

在優化的條件下確定每個有機酸的保留時間，實現了18 種有機酸的定性（見圖4）。除異丁酸與正丁酸的分離度為1.39 未達到完全分離外，其它相鄰有機酸的分離均實現完全分離[27]。

圖4 優化條件下18 種混合標準品的HPLC 譜圖Fig.4 Chromatograms of 18 organic acid standards under optimum condition

2.3 標準曲線建立及方法的評價

在優化的條件下對5 個混合標準梯度進行檢測，將峰面積（y）和濃度（x）進行強制過原點的線性擬合，建立標準曲線，進行方法評價。標準曲線及其線性范圍與R2、檢出限、定量限、加標回收率、標準偏差的結果見表2。結果顯示，該方法的線性范圍較寬，標準曲線R2為0.9891～0.9999；檢出限0.084～0.941 mg/L，定量限0.280～3.138 mg/L，加標回收率93.03%～107.21%，相對標準偏差<3.70%，說明該方法線性良好，精密度和準確度高，可用于米香型白酒發酵液、米酒的檢測。

表2 有機酸組分的保留時間、線性范圍、標準曲線、相關系數、檢出限、定量限、加標回收率、標準偏差Table 2 Retention time,linear range,regression equation,correlation coefficient,limit of detection,limit of quantitation,recovery,RSD of organic acids by HPLC

2.4 米香型白酒發酵過程有機酸、pH、酒精度、總酸的變化

2.4.1 米香型白酒發酵過程有機酸的變化 米香型白酒發酵液中有機酸變化見圖5。主要有機酸的變化趨勢不一樣：檸檬酸和富馬酸呈現主酵明顯下降，而后酵趨于平穩的趨勢；L-蘋果酸、丙酮酸、奎尼酸呈現先升后降的趨勢，但峰值出現時間各不相同，前期上升可能與主酵期間酵母代謝活躍有關[3]，而L-蘋果酸的后期下降或與蘋乳發酵有關[29]；葡萄糖酸、琥珀酸、L-乳酸、異戊酸在發酵過程中一直呈上升趨勢，可能與釀酒酵母在主酵、耐酒精的產酸菌在后酵都容易產生此類酸有關[3,10,17]；乙酸、草酸和正丁酸在發酵前期變化不大、后期增加明顯，可能與釀酒酵母不易產生此類酸而耐酒精的產酸菌在后酵容易產生此類酸有關[3,17,30]；正戊酸在前9 d的發酵液中均未檢出，只在第12 d 發酵液中有檢出。不同發酵時間醪液的有機酸圖譜不相同，說明與發酵溫度、曲種、料水比一樣，發酵時間也是影響米香型白酒有機酸組成的一個關鍵工藝參數。

圖5 發酵過程18 種有機酸的變化情況Fig.5 The changes of 18 organic acids during fermentation

12 d 發酵是米香型白酒的常用工藝，故對12 d醪液的有機酸組成進行詳細的分析。12 d 發酵液的總有機酸含量為24505 mg/L，各有機酸濃度按由大到小的順序依次是：L-乳酸>乙酸>異丁酸>異戊酸>琥珀酸>葡萄糖酸>正丁酸>奎尼酸>丙酸>檸檬酸>甲酸>正戊酸>L-酒石酸>草酸>L-蘋果酸>丙酮酸>富馬酸>抗壞血酸。其中，占總有機酸比例達10%以上的有5 種，分別是L-乳酸（占19.76%）、乙酸（占15.64%）、異丁酸（占15.47%）、異戊酸（占14.28%）、琥珀酸（占13.30%）。與初始醪液相比，12 d 醪液中只有檸檬酸、L-蘋果酸、富馬酸的含量出現降低，降幅分別達到54.51%、64.34%、46.93%；其它有機酸均增加，增幅達100%以上的有機酸按由大到小的順序依次是葡萄糖酸（73.10 倍）、乙酸（38.64 倍）、奎尼酸（17.87 倍）、正丁酸（4.89 倍）、琥珀酸（3.88 倍）、甲酸（3.28 倍）、異丁酸（2.67 倍）、L-乳酸（1.85 倍）、丙酮酸（1.57 倍）、丙酸（1.56 倍）、異戊酸（1.22 倍）。

2.4.2 米香型白酒發酵過程中總酸、pH、酒精度、總有機酸的變化 發酵過程中醪液的pH、酒精度見圖6。酒精度在主酵期間增加明顯，前3 d 就達到最終酒精度的91.8%。pH 在整個發酵過程中呈下降趨勢，表明發酵過程游離氫離子在一直增加，且后酵也有較多的游離酸性物質產生；12 d 醪液的pH 較初始醪液降低了10.58%。

圖6 發酵過程pH、酒精度的變化Fig.6 Change of pH,alcohol by volume during fermentation

總酸、總有機酸的變化見圖7?？偹岷涂傆袡C酸在發酵過程中一直呈上升趨勢，12 d 醪液的總酸和總有機酸較初始醪液分別增加了2.42 倍和1.95 倍。后酵發酵液中酒精度高而對應的總酸和總有機酸呈增加趨勢，可能與發酵液中有源自釀酒小曲的耐酒精的乙酸菌、乳酸菌等存在有關[29?30]。

圖7 發酵過程總酸、總有機酸的變化Fig.7 Change of total acidity and total organic acid during fermentation

3 結論

利用反相高效液相-紫外二極管陣列法建立了米香型白酒中包括短鏈脂肪酸在內的18 種有機酸的定量分析方法。該方法線性好（R2>0.989）、定量限低（0.280～3.138 mg/L）、加標回收率高（93.03%～107.21%）、精密度好（<3.70%）。方法可同時準確定量測定揮發性短鏈脂肪酸和熱不穩定多元羧酸的檢測方法，為米香型白酒的品質控制提供了一個有效手段，也為果酒果醋發酵液等有機酸的檢測提供了一個潛在的方法。米香型白酒發酵過程中，pH、總酸、總有機酸的變化趨勢相對應，且12 d 醪液總有機酸占總酸的70%，說明本方法所監測到的有機酸覆蓋了發酵液酸性物質的絕大部分。不同有機酸隨時間的變化規律不同。12 d 醪液總酸和總有機酸較初始醪液分別提高了2.42 倍和1.95 倍，說明米香型白酒的發酵過程是一個明顯的增酸過程。L-乳酸、乙酸、異丁酸、異戊酸、琥珀酸在12 d 發酵醪中含量占比大于10%，為米香型白酒發酵液中含量高的5 種主要有機酸。乙酸、L-乳酸、異丁酸、異戊酸在發酵后期增加明顯，可能與后酵有能耐受高酒精度的產酸菌存在有關。不同發酵進程對應的有機酸分布差異較大，暗示著在其它參數一定的情況下選擇合適的發酵終止時間是控制米香型白酒有機酸組成的一個有效工藝手段。