基于適配體識別的金黃色葡萄球菌定性檢測試紙條的研制及應用

張云紅，彭云娉，盧春霞,2, ，黃 巧，嚴慧娟，魏 雪，任江濤

（1.長江師范學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物技術學院，重慶 408100；2.蘇州賽飛福德檢測科技有限公司，江蘇蘇州 215100；3.重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶 408100）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）隸屬于葡萄球菌屬，為革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，在適當?shù)臈l件下（20～37 ℃）可產(chǎn)生腸毒素（Staphylococcal enterotoxins,SEs），引起食物中毒[1]。據(jù)統(tǒng)計，在我國和美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數(shù)量占病原菌引起的食源性疾病的前五位[2?3]，對公共健康和食品安全帶來巨大威脅。我國食品中金黃色葡萄球菌總體污染現(xiàn)狀不容樂觀，常污染肉和肉制品、乳和乳制品、禽蛋類制品、熟食制品等[4]，目前，我國食品安全國家標準（GB 29921-2013規(guī)定食品中金黃色葡萄球菌的可接受水平限量值為100 CFU/g（mL）、最高安全限量為1000 CFU/g（mL）[5]。因此，發(fā)展簡便經(jīng)濟的的金黃色葡萄球菌快速檢測方法是保障食品質量安全的重要技術手段。

目前，金黃色葡萄球菌的鑒定和檢測方法主要有以下三種：（1）傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法：該法為金黃色葡萄球菌鑒定和檢測的“金標準”[6]，但操作步驟復雜，耗時較長（3～5 d），無法滿足快速檢測及批量樣品初篩的需要。（2）分子生物學檢測技術：主要包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）、環(huán)介導等溫擴增反應等[7?8]，PCR 方法靈敏度高，但需要昂貴的精密儀器和專業(yè)的技術人員，無法在基層推廣應用。（3）免疫學分析技術：該技術是目前檢測金黃色葡萄球菌及腸毒素最為常用的快速檢測技術，具有檢測快速、操作簡便等優(yōu)勢[9?10]。但其識別分子為抗體，抗體的制備需要免疫動物，存在周期長、成本高、抗體易受環(huán)境影響等不足?；诖?，核酸適配體作為一種新型識別分子進入研究者的視野，并逐漸成為研究熱點。

核酸適配體（Aptamer）是采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選獲得的可與靶標高特異性結合的一段單鏈核苷酸。其空間結構的多樣性可與多種靶標如細胞因子[11]、蛋白[12]、金屬離子[13]、小分子物質[14]、細胞[15]、微生物[16]等相結合。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有制備簡單、成本低、性質穩(wěn)定、應用范圍廣、易于標記和保存等優(yōu)點。因此，適配體作為一種新型識別分子在分析領域成為人們研究的焦點[17]。近些年，研究者們利用SELEX 技術已篩選多條金黃色葡萄球菌適配體[18?19]，并利用篩選出的適配體建立了多種快速檢測方法[20?21]。如Duan 等[20]將適配體固定在磁珠表面作為捕獲探針，以適配體功能化的雙色上轉換納米材料為檢測探針，構建了一種可同時檢測金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的新方法，該方法對兩種食源性致病菌具有寬的線性范圍（101～105CFU/mL）和低的檢測限（8、5 CFU/mL）。Abbaspour 等[21]充分結合電化學傳感器和核酸適配體的優(yōu)點，設計了一種基于雙適配體夾心的電化學傳感檢測方法，實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的定性及定量檢測。

在諸多的快速檢測技術中，試紙條層析技術具有操作簡單、快速、低成本、肉眼可見結果等優(yōu)點，被廣泛應用于批量樣品初篩和現(xiàn)場檢測[22?23]。但目前很少見到基于適配體識別的金黃色葡萄球菌試紙條的研究報道。為此，本研究將膠體金層析技術的簡便、快速和適配體的高親和力、低成本等優(yōu)勢充分結合，構建一種簡便、經(jīng)濟、快速的金黃色葡萄球菌適配體試紙條。與傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比，具有識別分子易制備、成本低廉等優(yōu)點，為食源性致病菌的快速檢測提供了新技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19155、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）O157:H7 ATCC25922、阪崎腸桿菌（Bntorobater sakazakii）ATCC29544、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae） 重慶市涪陵食品藥品檢驗所提供；氯金酸（純度>99%） Sigma-Aldrich公司；吐溫-20、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris（2-chloroethyl）phosphate,TCEP）、三磷酸脫氧腺苷（dATP）、鏈霉親和素、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、曲拉通X-100（Triton-100）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）、蔗糖、瓊脂糖 生物工程（上海）股份有限公司；實驗用水為超純水（≥18.2 MΩ·cm）；玻璃纖維膜（8906）、硝酸纖維素膜（CN140）、吸水紙（H-1）、PVC 底板（J-B6） 上海捷寧生物科技有限公司；畜禽肉、乳制品和涼拌菜食品 本地超市；金黃色葡萄菌核酸適配體[18]由生物工程（上海）股份有限公司合成。

FEI Tecnai G2 F20 場發(fā)射透射電子顯微鏡 美國FEI 公司；HM3030/HM3035 XYZ 三維劃膜噴金儀、ZQ4200 數(shù)控感應斬切機 上海金標生物科技有限公司；UV-2800 紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；5424R 臺式冷凍離心機 德國艾本德公司；MS3 basic 渦旋混合器 德國IKA 公司；Gel Doc XR System 凝膠成像系統(tǒng)、Powerpac 300電泳儀 美國BIO-RAD 公司；BSD-100 振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 適配體和探針序列及修飾 巰基修飾的適配體1（SH-apt 1）：5’-SH-C6-TCCCTACGGCGCTAACC CCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCA CCGTGCTACAAC-3’；生物素修飾的適配體2（Bioapt 2）：5’-Bio-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAAC CGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTA CAAC-3’；適配體1 互補DNA：5’-Bio-GTTGTAGCA CGGTGGCGGTGTGAGGCTGGGAGGACGGACTG GGGGGGTTAGCGCCGTAGGGA -3’。

1.2.2 納米金的制備與表征 根據(jù)檸檬酸鈉還原法[24]制備納米金顆粒（Goldnanoparticles,GNPs），將100 mL 0.01%氯金酸溶液加熱至沸騰，持續(xù)2 min，迅速加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，直到溶液變成透亮的酒紅色，繼續(xù)加熱10 min，停止加熱，冷卻至室溫，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將納米金溶液在400～800 nm 范圍內進行掃描，獲取金溶液的紫外-可見光光譜，測定納米金的最大吸收波長[25]。納米金顆粒的尺寸和形貌采用透射電鏡表征，將制備的金溶液超聲分散均勻后，滴在渡有碳膜的通網(wǎng)上，50 ℃干燥12 h，置于透射電鏡樣品臺，在100 kV 電壓下觀察金顆粒的形貌和粒徑[25]。

1.2.3 納米金-適配體1（GNPs-apt 1）偶聯(lián)物的制備與表征 參考文獻方法[26]將巰基修飾的適配體1 通過Au-SH 共價方式結合到納米金表面。首先取1 mL 納米金溶液，用0.1 mmol/L K2CO3調pH 至7.4，10000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去900 μL 上清，獲得濃縮的納米金溶液。加入適配體1 溶液，使其最終濃度為1 μmol/L，加入2 μL TCEP 溶液（1 mmol/L）中，常溫避光活化1 h，加入上述納米金溶液中，常溫下偶聯(lián)反應2 h。然后加入9 μL dATP 溶液（100 μmol/L），室溫反應1 h。封閉結束后，加入NaCl 溶液，使其終濃度達到80 mmol/L，老化30 min，置于4 ℃繼續(xù)老化過夜。將偶聯(lián)物于10000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清，用100 μL 重懸液復溶（20 mmol/L Tris-HCl（pH8.5），5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，1% BSA），4 ℃保存?zhèn)溆?。將上述制備的納米金-適配體1 偶聯(lián)物及適配體1 用4%的瓊脂糖凝膠電泳表征，電壓120 V，電泳時間40 min。

1.2.4 試紙條的制備 玻璃纖維膜的處理：將玻璃纖維膜裁成2.0 cm 和0.5 cm 寬的條狀，在處理液（0.1 mol/L Tris-HCl 溶液，1% NaCl，0.5% Tween-20，1% BSA，2%蔗糖，1% Triton X-100）中浸泡2 h，37 ℃烘箱中烘干，分別作為樣品墊和結合墊，用點膜噴金儀將GNPs-apt 1 復合物以20 μL/cm2的速率噴涂到結合墊上，25 ℃烘箱烘干備用。

T、C 線的制備：分別將生物素修飾的適配體2（Bio-apt2）或生物素修飾的互補DNA 與鏈霉親和素按摩爾比4:1 混合，即得到捕獲探針和質控探針。利用點膜噴金儀將捕獲探針和質控探針噴到硝酸纖維膜（NC 膜）上，分別作為檢測線（T 線）和質控線（C 線），25 ℃烘箱中烘干備用。

試紙條的組裝：將處理好的樣品墊、結合墊、NC 膜和吸水墊依次黏貼于PVC 底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2 mm，T 線與C 線間隔距離為7 mm，用切條機切成4 mm 寬的試紙條，與干燥劑一起裝于鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試紙條性能測定

1.3.1 可視化檢測限 將金黃色葡萄球菌用無菌SELEX 篩選緩沖液[18]（40 mmol/L Hepes（pH8.0）,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,2 mmol/L MgCl2,150 mmol/L NaCl）進行梯度稀釋，同時以SELEX 緩沖液設陰性對照，將制備好的試紙條插入200 μL 待測溶液中，5 min 后觀察結果，將T 線完全消失前的菌液濃度定為肉眼可視化檢測限。實驗重復3 次。

1.3.2 特異性分析 將鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7、阪崎腸桿菌和痢疾志賀氏菌用無菌SELEX 緩沖液稀釋成5×106CFU/mL的菌液，同時用SELEX 緩沖液作為陰性對照。將試紙條插入到200 μL的待測菌液中，5 min 后觀察結果，分析試紙條的特異性。每個實驗3 個重復。

1.3.3 實際樣品檢測 參照GB 4789.10-2016 執(zhí)行[6]，稱取25 g（mL）樣品加入到盛有225 mL的7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質袋中，充分均質，置于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，混勻。取50 μL 菌液用SELEX 緩沖液稀釋4 倍，加入到酶標板中，將試紙條插入菌液，5 min 后判讀結果。同時采用GB 4789.10-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗[6]進行驗證。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復測定三次，使用Origin 8.5 軟件制圖。

2 實驗結果

2.1 納米金質量鑒定

納米金的大小及形貌對核酸偶聯(lián)效率和檢測靈敏度至關重要[27?28]，有研究報道，納米金粒子直徑一般在15～30 nm 比較合適[29]。T 線和C 線的顏色是由納米金顆粒聚集到一定程度時形成肉眼可見的信號，若GNPs 粒徑過小，產(chǎn)生的顏色較淡，影響試紙條靈敏度；粒徑過大，位阻效應也相應增大，影響其在NC 膜上的流動性。從圖1a 中可以看出，本研究制備的納米金溶液呈晶瑩透亮的酒紅色，紫外光譜分析顯示，金溶液最大吸收峰波長為520 nm，為納米金的特征吸收峰。透射電鏡表征結果顯示（圖1b），GNPs形貌為球型，粒徑較為均一（約20 nm），分散性良好。

圖1 納米金紫外光譜圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig.1 Absorption spectra (a) and TEM images (b) of the synthesized GNPs

2.2 納米金-適配體偶聯(lián)物的表征

本研究采用4%瓊脂糖凝膠電泳驗證巰基化的適配體1 是否成功修飾到納米金表面，如圖2 所示，泳道1 為納米金-適配體1 偶聯(lián)物的條帶，泳道2 為巰基化的金黃色葡萄球菌適配體1，可以看出納米金-適配體1 偶聯(lián)物的遷移率比適配體1 遲緩較多，因為金顆粒標記核酸適配體后，分子量增大，遷移速率變慢。綜合以上，可初步判斷巰基化的適配體1 成功偶聯(lián)到納米金表面。

圖2 納米金-適配體1 和適配體1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The agarose electrophoresis of the GNPs-aptamer 1 and aptamer 1

2.3 適配體試紙條檢測原理

所構建的適配體試紙條檢測原理如圖3 所示。當樣品中有金黃色葡萄球菌時，目標菌和結合墊上包被的納米金-適配體1 特異性結合，隨著毛細管作用遷移到硝酸纖維素膜上，目標菌與T 線上包被的生物素化適配體2 結合，形成適配體1-目標菌-適配體2 夾心結構，納米金在T 線沉積顯色。納米金-適配體1 繼續(xù)層析至質控線（C 線），納米金表面的適配體1 與C 線上的生物素化互補DNA 結合，納米金沉積使C 線顯色。如果樣品中無目標菌，納米金-適配體1 在T 線上不富集顯色，繼續(xù)層析遷移與C 線上的互補DNA 發(fā)生結合，C 線顯色。

圖3 基于適配體試紙條檢測金黃色葡萄球菌原理圖Fig.3 Schematic illustration of aptamer-based lateral flow strip for detection of S.aureus

2.4 試紙條制備和檢測條件優(yōu)化

2.4.1 NaCl 濃度的確定 在納米金-適配體偶聯(lián)物制備過程中，加入適當濃度的鹽溶液“老化”處理，對提高適配體在納米金表面的偶聯(lián)效率至關重要[29]。本研究加入過量適配體（2 μmol/L），對照組不添加適配體，分別將實驗組及對照組加入NaCl 溶液，使其終濃度分別20、40、60、80、100 mmol/L，然后采用目測法確定NaCl 濃度。結果如圖4 所示，當NaCl濃度增加至80 mmol/L 時，對照組納米金沉淀聚集，顏色變藍，而實驗組由于適配體覆蓋在納米體金表面，保護納米金不團聚，納米金溶液仍保持紅色。故后續(xù)實驗選擇NaCl 濃度為80 mmol/L。

圖4 NaCl 濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of NaCl concentration by visual inspection

2.4.2 最小適配體偶聯(lián)濃度的確定 在納米金-適配體偶聯(lián)物制備中，合適的適配體濃度對提高金溶液穩(wěn)定性和檢測靈敏度較為重要。如適配體濃度過低，當體系中有NaCl 存在時，適配體對納米金起不到足夠的保護作用，金溶液不穩(wěn)定易沉聚變藍，另外，若納米金表面偶聯(lián)的適配體較少，特異性結合靶標的數(shù)量也相應較少，進而影響檢測靈敏度。本實驗采用目測法確定納米金標記最佳適配體濃度，分別向金溶液中加入不同濃度的適配體，室溫孵育5 min 后加入NaCl溶液（終濃度80 mmol/L），選擇金溶液仍保持紅色的最小適配體濃度即為納米金標記最小適配體用量。實驗結果見圖5，當適配體終濃度小于1 μmol/L時，金顆粒聚集變藍，此時的適配體濃度不足以穩(wěn)定納米金溶液；當適配體終濃度≥1 μmol/L 時，膠體金溶液保持紅色，表明此時納米金-適配體體系較為穩(wěn)定。因此，選擇1 μmol/L 為穩(wěn)定納米金溶液的最小適配體濃度。

圖5 適配體濃度優(yōu)化Fig.5 The optimum of aptamer concentration by visual inspection

2.4.3 納米金-適配體1 及捕獲探針包被量的確定納米金-適配體1（GNPs-apt 1）包被量對試紙條檢測信號有較大影響[24]，包被量過多易導致背景信號提高，包被量太少，在高濃度的待測靶標條件下很容易飽和，導致T 線上的信號強度降低，影響檢測靈敏度。本研究固定T 線捕獲探針濃度為50 μmol/L，將GNPs-apt 1分別按1:1、1:2、1:4、1:6 體積比稀釋，固定同等體積噴于結合墊上，檢測5×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌。結果如圖6a 所示，隨著納米金-適配體1 濃度的降低，試紙條T 線顯色逐漸變弱，當稀釋倍數(shù)為1:4 時，檢測信號明顯變弱。因此，結合墊上GNPs-apt 1的稀釋比例選擇1:2。

圖6 納米金-適配體1（a）和捕獲探針（b）包被濃度對T 線顯色的影響Fig.6 Visual colorc hanges at the test lines with different concentrations of GNPs-aptamer 1 and capture probe

T 線上的捕獲探針（鏈霉親和素-生物素化適配體2）包被濃度影響與GNPs-apt 1的結合比例，最終影響試紙條的檢測靈敏度。捕獲探針包被濃度低，T 線顯色不清晰，濃度高時易出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象。本研究將捕獲探 針分別稀釋 50、25、12.5、6.25、3.12 μmol/L，固定同等體積噴于硝酸纖維素膜上，檢測濃度為5×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌，比較T 線顯色效果。從圖6b 中可以看出，當捕獲探針濃度小于25 μmol/L 時，T 線顯色明顯減弱，因此，捕獲探針包被濃度選擇25 μmol/L。

2.4.4 樣品溶液對試紙條檢測性能的影響 樣品溶液的pH 和離子成分對適配體與目標物的結合有顯著影響，因此最佳的運行緩沖液對試紙條檢測性能至關重要。本實驗分別采用SELEX 篩選緩沖液[18]、10 mmol/L PBS 緩沖液（8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，1.44 g Na2HPO，pH7.4）、Tris 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2、120 mmol/L NaCl、0.1% Tween-20,1% PEG 20000,2% 蔗糖，pH8.5）和無菌生理鹽水稀釋金黃色葡萄球菌，考察不同樣品溶液對檢測性能的影響。結果如圖7 所示，選擇SELEX 緩沖液作為樣品檢測溶液時，試紙條T 線顯色信號最強，這可能與該適配體篩選時使用的緩沖液一致有關。有研究證明，改變適配體稀釋溶液及離子強度可能影響適配體的三維折疊結構，進而影響靶標與適配體的識別及相互作用[30]。因此，后續(xù)實驗選擇SELEX 緩沖液作為樣品檢測溶液。

圖7 樣品溶液對適配體試紙條檢測性能的影響Fig.7 The influence of sample solution on the detection performance of aptamer-based lateral flow strip

2.5 試紙條檢測性能評估

2.5.1 可視化檢測限 采用同一批次試紙條檢測不同濃度的金黃色葡萄球菌ATCC6538，觀察T 線顯色信號，確定試紙條肉眼可視化檢測限。結果如圖8所示，隨著金黃色葡萄球菌濃度的降低，試紙條上的檢測信號逐漸減弱。當濃度為2×102CFU/mL 時，檢測線肉眼完全不可見。因此，該適配體試紙條對金黃色葡萄球菌的裸眼可視化檢測限為2×103CFU/mL。

圖8 適配體試紙條靈敏度分析Fig.8 Sensitivity analysis of the aptamer-based lateral flow strip

2.5.2 試紙條特異性 采用本研究構建的試紙條分別檢測相同濃度（5×106CFU/mL）的金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、大腸埃希氏菌O157:H7 ATCC25922、單增李斯特菌ATCC19155、阪崎腸桿菌ATCC29544、痢疾志賀氏菌，以確定適配體試紙條的特異性，結果如圖9 所示，試紙條對兩株金黃色葡萄球菌的檢測結果為陽性，其他食源性致病菌的檢測結果為陰性，表明該試紙條具有優(yōu)良的特異性。

圖9 適配體試紙條特異性分析Fig.9 Specificity analysis of the aptamer-based lateral flow strip

2.5.3 實際樣品檢測 為驗證本試紙條的實用性和可行性，本實驗選取畜禽肉、乳制品、涼拌菜等116個食品樣品，分別采用國標法[6]和本方法進行檢測。結果表明（表1），本方法檢測結果與國標方法完全一致，肉制品和涼拌菜樣品中金黃色葡萄球菌的檢出率均為3.85%和3.33%。以上結果表明，該方法操作簡單、檢測快速、結果準確，適用于批量樣品中金黃色葡萄球菌的快速定性檢測，在食品安全快速檢測方面具有良好的應用前景。

表1 本方法與國家標準方法檢測結果對比Table 1 Comparison of detection results of the proposed method and the GB sandard method

3 結論

以核酸適配體為特異性識別分子，代替抗體構建了一種基于雙適配體夾心模式的層析試紙條，在優(yōu)化條件下（NaCl 濃度為80 mmol/L、適配體偶聯(lián)濃度為1 μmol/L、結合墊上納米金-適配體的稀釋體積比為1:2、捕獲探針濃度為25 μmol/L），該試紙條對金黃色葡萄球菌的可視化檢測限為2×103CFU/mL，檢測時間為5 min，在實際樣品檢測中，檢測結果與國標方法完全一致。與傳統(tǒng)的免疫膠體金試紙條相比，本方法識別分子可人工合成，故成本可大大降低。與基于適配體的其他快速檢測方法相比[20?21]，本方法不需制備納米材料和對適配體過多的功能化修飾，不需要特殊的專業(yè)設備。本方法具有操作簡單、檢測結果直觀、準確性高等優(yōu)點，為批量樣品初篩和食品安全監(jiān)管提供了新的技術支撐。