雞桑、華桑和桑的根皮中7 種核苷類成分的含量測定

黎海靈，黃艷萍,，周 游，陳旭冰, ，徐 金，周 濃,,

（1.大理大學藥學院，云南大理 671000；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120）

桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥根皮稱為桑白皮，其藥用歷史悠久，始載于《神農本草經》，是瀉白散、華蓋散、桑白皮湯等古代經典名方的重要組成藥味[1]。2020 版《中國藥典》一部記載桑白皮味甘、寒，歸肺經，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少，面目肌膚浮腫等功效[2?3]。桑科植物雞桑（Morus australisPoir.）或華桑（Morus cathayanaHemsl.）的干燥根皮稱為崖桑皮，其入藥與桑白皮具有相似的功效，作為川渝民用藥材被2010 版《四川省中藥材標準》收載[4]。桑白皮因具有降血脂[5?7]、鎮痛抗炎[8?9]、抗癌保肝[10]、免疫調節[11]等藥理作用，于2002 年被列入衛生部發布的保健食品類中藥名單中[12]。同時，桑白皮還常被用于制作具有一定保健功能的藥膳食用，例如麻黃連翹桑白皮湯、桑白皮粥、南杏桑白皮豬肺湯等[13?14]。因此，桑白皮在疾病康復和日常食補中發揮著重要作用。

雞桑、華桑和桑皮中研究較多的為黃酮類[15?16]、茋類[17]、生物堿類[18?19]、植物甾醇類[20?21]、香豆素類和多糖類[22?23]等活性成分，但對其含有的核苷類成分鮮有報道。核苷是一類由含氮堿基與糖縮合而成的糖苷，是構成生命體DNA 和RNA的基本物質，具有抗腫瘤[24?25]、抗菌[26?28]、抗血小板聚集[29?30]、免疫調節[31?33]等多種功效，這與桑皮的生物活性具有一定的關聯性，可為其藥材質量評價提供參考。目前關于不同產地雞桑、華桑和桑的核苷類成分比較研究未見報道，本研究采用HPLC 法測定雞桑、華桑和桑的根皮中7 種核苷類成分的含量，并采用聚類分析和主成分分析法對其進行評價，比較雞桑、華桑和桑化學成分的差異，探究三種桑的質量等同性，以期為雞桑、華桑代替桑使用，解決桑白皮基源單一的狀況提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑、雞桑、華桑 2018 年10 月采集于重慶市相關區縣，對照藥材購自相關中藥材市場及公司，共58 批（表1），經重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為桑科植物雞桑（Morus australisPoir.）、華桑（Morus cathayanaHemsl.）和桑（Morus albaL.）的根皮；腺嘌呤、腺苷（批號分別為：110886-200001、110879-200202，純度均≥98%） 中國食品藥品檢定研究院提供；胞苷、次黃嘌呤、鳥苷、尿嘧啶、2'-脫氧腺苷（批號分別為：PHA0053、PHA0024、PHA0064、PHA0060、PHA0071，純度均≥98%） 南京都萊生物技術有限公司；甲醇 色譜純，德國默克公司；水娃哈哈純凈水。

表1 不同產地的樣品信息Table 1 The information of samples from different origins

LC-20AT 型高效液相色譜儀 日本島津集團；SB-5200DTN 型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TDZ5-WS 型多管架自動平衡離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；ML204 型分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DZF-6050MBE 型電熱恒溫真空干燥箱 上海博訊實業有限公司；CP225D 型分析天平 德國Sartorius 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 選擇自秋末葉落時至次春發芽前采挖的根部，刮去黃棕色粗皮，縱向剖開，剝取得到根皮[2,4]。因同一采收期不同植株的含量有所差異，實驗采用不同居群單株采樣以減少實驗誤差。將精選樹齡相近的桑、雞桑、華桑的根皮洗凈后置于45 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎過三號篩，密封儲存于4 ℃，用于品質分析。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品胞苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷，加水溶解，配制成濃度分別為0.007、0.061、0.018、0.033、0.042、0.006、0.017 mg/mL的對照品混合溶液。用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末0.500 g，置具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，混勻，在室溫條件下超聲（300 W，40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量后，以4000 r/min 離心10 min，吸取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾即得[34]。

1.2.4 色譜條件 Venusil MP C18（5 μm，250 mm ×4.6 mm）色譜柱；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫程序如下表2 所示。檢測波長為260 nm；流速：1.0 mL/min；進樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase

1.3 方法學考察

1.3.1 線性關系考察 取1.2.2 對照品溶液制備液，按一定梯度稀釋后在1.2.4 項色譜條件下進行測定，以各對照品濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 精密度考察 取混合對照品溶液，按1.2.4 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄各成分峰面積。

1.3.3 重復性考察 取樣品粉末0.500 g，平行6 份，按1.2.3 項下的提取方法制備供試品溶液，按

1.2.4 項下色譜條件進行測定，記錄各成分峰面積。

1.3.4 穩定性考察 取同一供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h 按1.2.4 項下色譜條件進行測定，記錄各成分峰面積。

1.3.5 加樣回收率考察 取6 份0.250 g 樣品粉末，加混合對照品適量，按1.2.3 項下的提取方法制備供試品溶液，按1.2.4 項下色譜條件進行測定，記錄各成分峰面積。

1.4 數據處理

采用Excel 2010 軟件進行數據整理，運用SPSS 22.0 軟件進行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 樣品的液相色譜測定結果

按照上述色譜條件對7 種核苷成分進行分析，對照品、樣品色譜圖見圖1。結果表明各成分分離度較好，符合分析要求。

圖1 對照品（A）、華桑（B）、雞桑（C）和桑（D）的HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrums of references (A)，Morus cathayana(B),Morus australis (C) and Morus alba (D)

2.2 方法學考察結果

2.2.1 線性關系考察 測得7 種核苷的線性方程及其線性范圍，如表3 所示。結果表明，7 種核苷的濃度與峰面積成線性關系，且線性關系良好。

表3 7 種核苷的標準曲線和線性范圍Table 3 Standard curves and linear ranges of 7 nucleosides

2.2.2 方法學其他項考察結果 由表4 可知，胞苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷的精密度、重復性、穩定性、加樣回收率的RSD 均小于3%，且加樣回收率在97.49%～101.45%之間，表明制備與檢測方法的準確性良好，符合要求。

表4 精密度、重復性、穩定性、加樣回收率考察結果（RSD%）Table 4 Precision,repeatability,stability and recovery (RSD%)

2.3 樣品中7 種核苷的含量

按1.2.3 項下方法制備雞桑、華桑和桑樣品共58 批的供試品溶液，平行3 份。在1.2.4 項色譜條件下進行測定，計算雞桑、華桑和桑皮根皮中7 種核苷類成分的含量，結果見表5。由表可知，所有樣品均檢測到了7 種單體核苷成分。雞桑與華桑中胞苷含量范圍在0.016～0.270 mg/g，次黃嘌呤含量范圍在0.009～0.945 mg/g，鳥苷含量范圍在0.039～0.325 mg/g，腺嘌呤含量范圍在0.015～0.377 mg/g，尿嘧啶含量范圍在0.059～0.429 mg/g，腺苷含量范圍在0.016～0.311 mg/g，2'-脫氧腺苷含量范圍在0.003～0.327 mg/g。桑白皮中胞苷含量范圍在0.030～0.196 mg/g，次黃嘌呤含量范圍在0.032～0.324 mg/g，鳥苷含量范圍在0.067～0.353 mg/g，腺嘌呤含量范圍在0.073～0.370 mg/g，尿嘧啶含量范圍在0.066～0.322 mg/g，腺苷含量范圍在0.046～0.262 mg/g，2'-脫氧腺苷含量范圍在0.025～0.162 mg/g。雞桑與華桑的胞苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷的含量略低桑。從整體上看，雞桑與華桑中核苷成分略低于桑；相同采集地點不同居群雞桑、華桑和桑的根皮中核苷類含量具有差異，可能是由于生長地域、自然條件、栽培管理等不同引起次生代謝成分組成和含量的變化[35]。

表5 樣品中7 種核苷類的含量（，n=3，mg/g）Table 5 Contents of 7 nucleosides in the sample（,n=3,mg/g）

表5 樣品中7 種核苷類的含量（，n=3，mg/g）Table 5 Contents of 7 nucleosides in the sample（,n=3,mg/g）

續表 5

2.4 兩獨立樣本t 檢驗

兩獨立樣本t 檢驗是對兩個樣本均值檢驗，比較兩樣本中各成分含量的差異性。以雞桑和華桑樣本為一類，以桑樣本為另一類，采用SPSS 22.0 統計軟件對兩類樣本的7 種核苷類含量的數據進行獨立樣本t檢驗分析，如表6 所示。7 種單體核苷均具有方差相等（P1>0.05），（P2>0.05），表明以雞桑和華桑制成的崖桑皮在核苷類成分層面與以桑制成的桑白皮無顯著性差異，崖桑皮可代替桑白皮藥用以緩解桑皮供應不足的問題。

表6 獨立樣品t 檢驗Table 6 The results of t-test

2.5 主成分分析

主成分分析是利用降維的思想，在損失很少信息的前提下把多個指標轉化為幾個綜合指標的多元統計方法[36]。利用SPSS.22.0 對58 批樣品中7 種核苷成分進行KMO 和Bartelett 球形度檢驗，結果顯示KMO 統計量=0.640，Bartelett 球形度檢驗卡方統計量=141.452，自由度=21，P<0.001，表明數據適合做主成分分析。通過對58 批樣品的單體核苷含量進行主成分分析，并提取了2 個主成分（特征值>1）進行分析，如表7 所示。主成分1的特征值為2.758，特征貢獻率為39.401%；主成分2的特征值為1.673，特征貢獻率為23.902%，2 個主成分的累積貢獻率為63.303%。由表7 可知，主成分1 主要反映了鳥苷、尿嘧啶成分的主要信息；主成分2 主要反映了2'-脫氧腺苷成分的主要信息。對提取的主成分進行主成分得分計算（得分系數Z標準化數據）以及排序。計算公式：

表7 樣品主成分陣距Table 7 Principal component matrix of samples

如表8 所示，對主成分1 來說，樣品Y4的得分最高；對主成分2 來說，樣品Y4的得分最高；綜合得分最高的是樣品Y4，說明樣品Y4的鳥苷、尿嘧啶和2'-脫氧腺苷的含量較多，起到了主導的作用。根據2 個主成分的得分，并繪制散點圖，見圖2。如圖，可將58 批樣品分成4 組。其中，樣品Y4 為第1 組；樣品Y1、Y26、Y28、Y38 為第2 組；樣品S5、S6、S10、Y19、Y20、Y21 為第3 組，其余的47 組樣品均聚在一起，可看成一大組，即為第4 組。說明主成分分析未能將崖桑皮與桑白皮區分開來。

圖2 樣品主成分散點圖Fig.2 Principal component scatter charts of samples

表8 樣品主成分得分、綜合得分及其排序Table 8 Scores of principal components,comprehensive scores and ranking for samples

2.6 聚類分析

聚類分析是一種可將一組數據按照本身內在的規律較合理地分為幾類的探索性的分類方法[33]。利用SPSS 22.0 對58 批樣品采用Euclidean 法進行聚類分析，結果如圖3 所示。當歐氏距離為10.0 時，58 批樣品可被分為4 大類：第Ⅰ類：Y4；第Ⅱ類：Y34、Y36；第Ⅲ類：S10、Y38；第Ⅳ類：剩余的樣品。

圖3 樣品的聚類分析Fig.3 Results of cluster analysis of all samples

其中，第Ⅰ類與上述主成分分析中的第1 組相對應；第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類與2、3、4 組相對應。雖然有些類別和組別相互交叉，但聚類分析結果與主成分分析結果基本一致。綜上所述，核苷含量相近或相同的崖桑皮與桑白皮在主成分和聚類分析中多距離較近，雞桑、華桑和桑以核苷類成分為指標的層面存在交叉，表明各產地的雞桑、華桑的核苷類成分含量與桑無明顯差別。

3 結論

本文對雞桑、華桑和桑的根皮中7 種核苷的含量進行測定，結果表明，58 批樣品中均含有胞苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷這7 種核苷，說明雞桑、華桑和桑的根皮中的核苷類成分較為相似。對58 批樣品進行主成分分析和聚類分析，結果表明不同基源桑屬根皮的核苷含量有所不同，桑中7 種核苷的含量略高于雞桑和華桑。與桑白皮標準藥材相比，桑中的7 種成分含量顯著高于標準藥材桑白皮中7 種單體核苷的含量(P<0.05)，說明采集的桑樣品符合藥用指標。雞桑、華桑根皮中的7 種單體核苷含量基本高于標準藥材崖桑皮中7 種核苷的含量。雞桑、華桑和桑的根皮中7 種單體核苷含量雖略有不同，但是區別不明顯，它們屬于同屬不同種植物，基源相近，根皮的化學成分較為相似。

整體上來說，桑的根皮較其他雞桑和華桑的根皮品質較好。但它們之間具有相同的活性成分，以華桑與雞桑來源的崖桑皮藥材中7 種單體核苷的含量和組成均無明顯差異(P>0.05)，其核苷類成分具有一定的等同性，建議臨床應用中應擴大對雞桑和華桑的使用，以期崖桑皮代替桑白皮使用，解決桑白皮基源單一的狀況。