長壽人群飲食中膳食纖維對C57BL/6小鼠的抗氧化效果

饒川艷，于曉涵，梅麗華，聶夢琳，李全陽, ，李 麗,3,

（1.廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所，廣西南寧 530007；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530000；3.廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室，廣西南寧 530007）

膳食纖維被譽為第七大營養素，不僅是維持生物體多項生理功能必不可少的天然物質，還具有抗氧化、抗病毒、預防癌癥以及免疫調節等功能[1?5]。隨著時間的推移，機體臟器組織衰老，導致機體組織功能下降，極易引發疾病甚至死亡[6]。前人認為自由基和活性氧在機體內累積，是造成氧化應激而導致機體加速衰老的原因之一[7]。有研究發現機體神經退行性疾病和老年疾病通常伴隨著機體氧化應激反應的發生而發生[8]。

廣西巴馬是世界著名的長壽之鄉，本團隊前期對廣西巴馬長壽人群飲食研究發現：廣西巴馬長壽人群飲食以高膳食纖維食物為主，其中膳食纖維的攝入量占除水外6 大營養素攝入量總和的8.22%[9?10]。本研究從廣西巴馬人群膳食中最具代表性果蔬入手開展研究，經過調查這些代表分別是：香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜和茶樹菇[10]。果蔬膳食纖維中的纖維素、半纖維素、木質素、抗性淀粉、果膠、多糖等能夠對機體的血糖、血脂和免疫功能進行調節，同時還能夠調節腸道菌群、促進腸道健康，以及增強機體康腫瘤的能力[11?15]。為此，本研究選取這些長壽老人膳食中最具代表性的香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶樹菇膳食纖維，以C57BL/6 小鼠為研究對象，通過對小鼠生長特性和小鼠機體的抗氧化效果評估，探究長壽人群膳食中膳食纖維在延緩衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6 小鼠 6 周齡，SPF 級，雄性廣西醫科大學（實驗動物生產許可證號：SCXK（桂）2014-0002）；基礎飼料 北京科奧協力飼料有限公司；MDA 試劑盒、總抗氧化活性（T-AOC）試劑盒、總超氧化歧化酶（T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒 南京建成生物研究所；脂褐素（Lip）試劑盒 索萊寶試劑公司；香蕉膳食纖維、臍橙膳食纖維、紅薯葉膳食纖維、南瓜苗膳食纖維、苦荬菜膳食纖維、空心菜膳食纖維、茶樹菇膳食纖維為實驗室自制。

KC-701 超微粉碎儀 北京開創同和科技發展有限公司；YL100L2-4 型飼料造粒機 淄博銀啟機械制造有限公司；JRA-2 型數顯磁力攪拌水浴鍋 金壇市科杰儀器廠；3-18KS 型冷凍離心機 Sigma（中國）；TG16W 型微量高速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；WGUL-230BE 型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；BSA124S 天平 賽多利斯科學儀器（中國）有限公司；GENESYS 10S 型 UVVIS 分光光度計 Thermo（中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 膳食纖維的制備 稱取過篩后的果蔬原料，按照一定固液比加入蒸餾水，混勻后于70 ℃熱水浴提取3 h。提取結束后，冷卻至室溫，于10000 r/min 離心15 min，沉淀真空冷凍干燥得不溶性膳食纖維（IDF）；上清液65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉至燒杯中，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8000 r/min 離心10 min后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維（SDF）。

1.2.2 實驗飼料的設計 依據前述研究結果，綜合王芳[10]及蔡達[16]對廣西巴馬長壽老人飲食的調查結果，結合人與動物給藥劑量的換算方法，設計膳食纖維飲食10 組，對照組1 組。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7 為7.5%單一膳食纖維添加組，分別是香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶樹菇膳食纖維；R8 為7.5%復合膳食纖維組（其中香蕉:臍橙:紅薯葉:南瓜苗:苦荬菜:空心菜:茶樹菇=0.5:0.5:1:1:1:1:1）；R9 為15%復合膳食纖維組；R10 為30%復合膳食纖維組；C1 為全基礎飼料對照組。

1.2.3 小鼠分組及采樣 55 只C57BL/6 小鼠隨機分為11 組，每組5 只，為別為C1、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9 和R10。飲食干預前，6 周齡小鼠基礎飼料適應性喂養一周，適應期間各組小鼠不限飲食，自由飲水。適應期結束后收集小鼠糞便，繼而開展飲食干預試驗，試驗期間小鼠自由飲食、飲水，連續喂飼4 周。飼喂結束后，所有小鼠禁水禁食12 h，稱量體重，麻醉后摘取眼球取血，于冰上解剖，取心、肝、脾、腎，保存于?80 ℃；所采集血液于4 ℃環境中靜置12 h 后以4000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，保留上清液并分裝，保存于?80 ℃，待后續檢測生化指標。

1.2.4 臟器系數的計算

其中，m1為臟器質量，g；m2為小鼠體重，g。

1.2.5 小鼠抗氧化指標的測定 將解剖取出的肝臟組織，稱重，加入9 倍的磷酸緩沖液，在冰浴中使用勻漿器進行勻漿，制得10%肝臟組織勻漿液，于4 ℃、4000 r/min 條件下離心10 min。取肝臟組織上清液與血清，使用南京建成生物試劑盒測定其MDA、Lip 含量，T-SOD、GHS-Px 活力以及T-AOC 水平。

1.2.6 綜合量化評價方法 參考李全陽等[17]的綜合量化方法，對10 種配方飲食中3 項抗氧化指標、2 項氧化指標進行指標的正向化和歸一化處理。正向化處理公式：

式中，yij為樣品ij的正向化值；xij為ij 樣品某項逆向指標的測定值。歸一化處理公式：

式中，yij為樣品i的歸一化值；xij為樣品某項指標測定值。

通過指標正向化和歸一化處理，初步對10 種配方飲食的抗氧化衰老效果進行綜合量化評價，以直觀反映不同配方飲食對抗氧化應激的作用效果。

1.3 數據分析

實驗數據采用 SPSS19.0 軟件進行統計分析，實驗數據以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，P<0.05 表示數據具有統計學意義，使用Origin 8.1 繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同膳食纖維對小鼠體重的影響

體重作為衡量機體健康狀況的重要指標之一，體重增長的速率可以直觀的反映機體生長發育情況[18]。由表1 可知，試驗結束時，與對照組相比，除R5 外，其余各組小鼠體重總增長量均無顯著性差異（P>0.05）。R5 組小鼠體重增長量顯著低于對照C1組（P<0.01），說明苦荬菜膳食纖維能抑制小鼠體重的增長。R8、R9 和R10 處理組，隨著混合膳食纖維劑量的增大，小鼠體重增長量減小，表明在一定劑量范圍內，高劑量的混合膳食纖維能夠抑制小鼠體重的增長。張玲[19]給6 周齡健康雄性小鼠分別飼喂含20%可溶性膳食纖維微晶纖維素（MCC）、28%不可溶性膳食纖維燕麥β-葡聚糖以及不含膳食纖維的飼糧21 d 后發現，3 組小鼠體重差異均不顯著（P>0.05）；王賽男等[20]研究了大豆不溶性膳食纖維對高脂誘導小鼠肥胖的預防作用及其機理，研究發現大豆不溶性膳食纖維可以控制小鼠體重的增長。對照本研究結果，表明了在小鼠飲食中添加長壽人群飲食中的膳食纖維不會影響小鼠的正常發育，且R5 可以抑制小鼠體重的增長。

表1 膳食纖維飲食對各種小鼠體重的影響（n=5）Table 1 The effects of characterized dietary on body weight of mice in each group（n=5）

2.2 不同膳食纖維對小鼠臟器系數的影響

臟器系數是動物試驗中常用的指標，衰老或受損的臟器重量會發生變化，因此臟器系數也隨之而改變，臟器系數減小，表示臟器萎縮或其他退行性改變[21]。由表2 可知，與對照組C1 相比，除R7、R3 外，其余各組小鼠心臟系數均有所提高，其中R8、R9 小鼠心臟系數提高了7.22%（P<0.05）。和C1 對照組相比，各組膳食纖維飲食小鼠肝臟系數均有所下降，其中R5、R7、R8 小鼠肝臟系數分別下降了13.51%、21.43%和34.56%（P<0.01）；R2、R4、R9、R10 小鼠肝臟系數分別下降了8.88%、9.84%、9.65%、10.81%、5.98%（P<0.05）。除R5 組外，其余各組膳食纖維食組腎臟系數與對照組C1 腎臟系數相比，均無顯著性差異（P>0.05）。與C1 對照組相比，膳食纖維飲食組除R7、R8 外，其余各組小鼠脾臟系數均有所提高，其中R4、R10 小鼠脾臟系數分別提高了10.00%、15.00%（P<0.05）。龍婷婷等[22]的研究發現，高劑量的白尾參多糖明顯促進了小鼠脾臟和胸腺的增大。對照本研究結果，認為在小鼠飲食中添加巴馬長壽人群飲食中的膳食纖維，可以延緩小鼠心臟、腎臟、脾臟的退化。

表2 膳食纖維飲食對各組小鼠臟器系數的影響（n=5）Table 2 Effects of characterized dietary on organ coefficients of mice（n=5）

2.3 不同膳食纖維對小鼠脂過氧化產物含量的影響

2.3.1 不同膳食纖維對小鼠MDA 含量的影響 膳食纖維飲食干預后各組小鼠血清和肝臟組織中MDA 含量的檢測結果如表3 所示。

表3 小鼠血清和肝臟組織中MDA 含量（n=5）Table 3 The MAD content in serum and liver of mice（n=5）

MDA 作為脂質過氧化的生物標志物，可以用于評估脂質的氧化程度[23]。從表3 可知，經過飲食干預后，與C1 組相比，膳食纖維飲食各組小鼠血清中MDA 含量均有一定程度的降低，其中R1、R3、R4、R6 和R10 分別降低了48.21%、53.74%、41.44%、57.56%和59.14%（P<0.01），R7 和R8 分別降低了39.27%和38.07%（P<0.05），R2、R5 和R9 分別降低了4.82%、20.00%和35.20%；C1 組小鼠肝臟中MDA 含量為（38.33±0.24）nmol/mgprot，與C1 組相比，各組小鼠中，除R5 組小鼠肝臟中MDA 含量升高了21.71%（P<0.01）外，R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R10 各組小鼠肝臟中MDA的含量分別極顯著降低了46.93%、62.01%、67.49%、33.81%、50.80%、68.88%、72.16%和77.59%（P<0.01），R3 組小鼠肝臟中MDA 含量顯著降低了10.59%（P<0.05）。劉佳維等[24]研究發現，400 mg/kg的紅參多糖使得小鼠血清和肝臟中的MDA 含量分別降低了12.8%和40.23%。對照本研究結果，認為在小鼠飲食中添加巴馬長壽人群飲食中的膳食纖維，對小鼠體內的脂質過氧化過程具有一定的抑制作用。

2.3.2 不同膳食纖維對小鼠Lip 含量的影響 飲食干預后各組小鼠血清和肝臟組織中Lip 含量的檢測結果如表4 所示。

Lip 又稱老年素，沉積于肝臟、心機、神經等組織衰老細胞中，其隨著細胞老化而增多，是衰老的重要指標之一[25]。肝臟是機體重要器官之一，在保護機體生理過程中發揮重要作用，與機體新陳代謝、排泄和儲存等幾個重要功能有關，且為內源性及外源性代謝物提供基本的解毒功能[21]。從表4 可知，經過飲食干預后，與C1 對照組相比，膳食纖維飲食各組小鼠血清中Lip 含量均顯著降低，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10 血清中Lip 含量分別極顯著降低了19.63%、26.70%、24.31%、27.98%、21.22%、26.88%、32.41%、34.93%、22.77%、34.08%（P<0.01）；C1 對照組肝臟中Lip 含量要高于其他膳食纖維飲食組，與R5、R7、R8 三組之間無顯著性差異（P>0.05）；與C1 對照組相比，R1、R4、R6、R9、R10 肝臟中Lip 含量分別極顯著降低了30.96%、31.84%、24.32%、24.32%、25.65%（P<0.01），R2、R3 肝臟中Lip 含量分別顯著降低了15.04%、16.36%（P<0.05）。李海飛等[26]發現，與衰老對照組相比，低劑量的MS 活性糖可將致衰小鼠肝臟組織中Lip 含量降低了6.80%；Pan 等[27]的研究表明，洛巴伊口蘑多糖使得D-半乳糖至衰老小鼠肝臟組織中Lip的含量降低了22.91%。綜上所述，本研究中的R1、R4、R6、R9、R10 這5 種膳食纖維飲食清除小鼠機機體Lip的效果更好些。

表4 小鼠血清和肝臟組織中Lip 含量（n=5）Table 4 Lip contents in serum and liver of mice（n=5）

2.4 不同膳食纖維對小鼠抗氧化酶活力的影響

2.4.1 不同膳食纖維對小鼠SOD 活力的影響 飲食干預后各組小鼠血清和肝臟組織中SOD 活力的檢測結果如圖1 所示。

圖1 小鼠血清（a）和肝臟組織（b）中SOD 活力（n=5）Fig.1 The SOD activity in serum (a) and liver (b) of mice (n=5)

SOD 在清除自由基方面能發揮重要的作用，與對照相比，在許多病理模型中，SOD的活力顯著低于對照[28]。由圖1 可知，飲食干預后，與C1 相比較，膳食纖維飲食各組小鼠血清中SOD 活力均有提高的趨勢，其中R1、R5 和R7 分別極顯著提高了24.22%、21.45%、19.71%（P<0.01），R4、R9、R10 分別顯著提高了17.24%、19.56%、16.22%（P<0.05），R2、R3、R6、R8 與C1 無顯著性差異（P>0.05），分別提高了4.29%、12.00%、4.00%、11.71%；與C1 組相比較，R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10 肝臟中T-SOD 活力分別極顯著提高了161.43%、159.39%、193.97%、175.17%、135.86%、125.41%、68.65%、103.39%、107.10%（P<0.01），R6 肝臟中T-SOD 活力提高了12.90%（P>0.05）。對于肝臟而言，抗氧化酶SOD 可以通過清除或者抑制自由基的產生，使肝臟細胞免于自由基的傷害[29]。Yang 等[30]的研究發現，諾麗果多糖顯著增加了高脂飲食小鼠肝臟TSOD的活力（P<0.05），并且100 mg/kg 諾麗果多糖灌胃使得高脂小鼠肝臟中Nrf2的水平較對照組提高了35%，有效減輕了高脂小鼠的氧化應激反應；Wang 等[31]的研究發現，400 mg/kg 和800 mg/kg 山竹多糖的攝入，分別將糖尿病大鼠肝臟組織中TSOD 活力顯著提高了52.32%和79.34%，有效緩解了糖尿病大鼠的氧化應激反應。與上述研究比較而言，本研究中R1、R2、R3、R4、R5、R7、R9、R10 這8 種配方飲食在提高肝臟組織中SOD 活力的效果更好些。

2.4.2 不同膳食纖維對小鼠GHS-Px 活力的影響飲食干預后各組小鼠血清和肝臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GHS-Px）活力的檢測結果如圖2 所示。

GHS-Px 是機體廣泛存在的過氧化物分解酶，可以保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾和損害，其活力降低是細胞組織壞死的標志之一[32]。由圖2 可知，膳食纖維飲食干預后，膳食纖維飲食各組小鼠除R10 組外，其余各組小鼠血清中GSH-Px 活性均有一定程度的提高，尤其是R1、R2、R3 三組小鼠血清中GSH-Px 活性分別極顯著提高了117.64%、136.08%和35.79%（P<0.01），R4、R5、R6、R7、R8、R9 血清中GSH-Px 活力分別提高了16.42%、17.12%、21.73%、8.82%、6.05%、1.90%，而R10 組小鼠血清中GSH-Px 活力極顯著降低了45.13%（P<0.01）；膳食纖維飲食各組小鼠肝臟中GSH-Px 活力顯高于C1 對照組，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10 肝臟中GSH-Px 活力分別提高了43.42%、67.18%、140.47%、60.11%、56.55%、42.09%、53.89%、50.00%、48.66%、26.40%（P<0.01）。Wang 等[33]的研究發現肥胖小鼠以400 mg/kg的劑量給予竹蓀多糖后，與模型肥胖組相比，給藥肥胖小鼠肝臟中GHS-Px 活力達到（89.81±4.31）U/mgprot，其活性高于模型肥胖組；Wahid 等[34]發現，四氯化碳中毒的大鼠在以100 mg/kg的劑量給車前草膳食纖維后，其肝臟組織中GHS-Px 活力可以恢復；Zhao[35]發現糖尿病大鼠肝臟中GHS-Px 水平低于健康大鼠，但是口服中等劑量魔芋膳食纖維后，其GHS-Px 水平較模型糖尿病對照小鼠提高了40.37%。本研究中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9 這9 種膳食纖維飲食在提高肝臟GHS-Px 活力水平方面具有良好的促進作用。

圖2 小鼠血清（a）和肝臟組織（b）中GHS-Px 活力（n=5）Fig.2 The GHS-Px activity in serum (a) and liver (b) of mice (n=5)

2.5 不同膳食纖維對小鼠T-AOC 水平的影響

飲食干預后各組小鼠血清和肝臟組織中總抗氧化能力（T-AOC）水平的檢測結果如圖3 所示。

圖3 小鼠血清（a）和肝臟組織（b）中T-AOC 水平（n=5）Fig.3 The T-AOC level in serum (a) and liver (b) of mice (n=5)

T-AOC 水平的高低可以反應機體非酶系統對自由基的代謝狀態以及機體內各抗氧化劑之間的協同作用。由圖3 可知，膳食纖維飲食干預后與C1 組相比較，除R3、R4、R10 外，其他各組小鼠血清的總抗氧化能力均有一定程度的提高。其中R5 血清中TAOC 極顯著提高了146.53%（P<0.01），R1、R6、R7 顯著分別提高了66.86%、101.80%、100.16%（P<0.05），R2、R8、R9 血清中T-AOC 分別提高了40.08%、24.73%、8.73%，然而R3、R4、R10 分別降低了7.92%、20.65%、8.57%；膳食纖維飲食各組小鼠肝臟中T-AOC 除R2 外，其余各組T-AOC 均高于C1-對照組。其中R1、R3、R6、R7、R8、R9、R10 肝臟中T-AOC 分別極顯著提高了，152.23%、203.69%、403.21%、611.72%、292.83%、334.94%、916.65%（P<0.01），R4 肝臟中T-AOC 水平提高了66.62%（P<0.05），R5 肝臟中T-AOC 水平提高了21.25%，然而R2 肝臟中T-AOC 水平降低了0.06%，R5 與C1 肝臟中T-AOC 水平無顯著性差異（P>0.05）。林為藝等[36]比較了鐵皮石斛多糖及非多糖成分對高糖、高脂、飲酒致代謝性高血壓大鼠模型體內抗氧化水平進行了比較，發現鐵皮石斛粗多糖將模型大鼠的T-AOC 水平顯著提高了63.49%；Niu 等[37]研究了海棠花多糖的免疫調節作用，研究發現，海棠花多糖可以增加免疫抑制模型小鼠血清和脾臟中T-AOC 水平，其中中劑量組將模型小鼠脾臟中T-AOC 水平提高了31.02%。本研究中R1、R3、R6、R5、R7、R8、R9、R10 這8 種膳食纖維配方飲食在提升C57BL/6 小鼠血清或肝臟T-AOC 水平具有一定的促進作用。

2.6 綜合量化評價

MAD 和Lip 是逆向指標，是機體脂過氧化產物和衰老指標，其值越大，表示機體氧化反應越強烈；SOD 和GHS-Px 為正向指標，是機體重要的抗氧化酶，參與機體的抗氧反應；T-AOC 是正向指標，表示機體的總抗氧化能力，其值越大，機體抗氧化能力越強。對10 種膳食纖維配方飲食初步進行綜合量化評價，以便更加直觀反映不同膳食纖維飲食在抗氧化上的作用效果，結果見表5。

由表5 可知，通過綜合量化評價，得到10 種膳食纖維飲食在抗氧化應激作用上的優劣順序為：R7>R10>R9>R8=R3>R6>R5>R1>R4>R2。其中，7種單一膳食纖維添加在抗氧化應激作用上的順序為：R7>R3>R6>R5>R1>R4>R2；3 種不同劑量混合膳食纖維添加在抗氧化應激作用上的順序為：R10>R9>R8。總體來說除R7 外，復合膳食纖維抗氧化效果優于單一膳食纖維，且在30%添加量內，復合膳食添加量越高，其抗氧化衰老效果越好。宋奇等[8]的研究發現，高膳食纖維攝入有助于緩解衰老機體的氧化應激水平；章海風等[38]的研究發現，多種混合膳食纖維較單一膳食纖維相比，其抗氧化應激反應更強。李全陽等[17]利用綜合量化評價初步建立起一套乳酸質量評價方法；宋奇等[8]利用綜合量化評價對5 種飲食模式進行綜合評價，得到5 種飲食模式的抗衰老效果排序。可見，綜合量化評價適用于不同對象的不同指標進行綜合評定。

表5 10 種膳食纖維配方飲食綜合量化評價結果Table 5 The comprehensive evaluations results of 10 dietary fiber formula diets

本研究則采用綜合量化評價，對其中的2 項衰老指標和3 項抗氧化指標采用綜合量化評價的方式進行綜合評價，通過嚴謹推算得到了10 種膳食纖維配方飲食對C57BL/6 小鼠抗氧化效果的優劣排序。其中茶樹菇膳食纖維、15%復合膳食纖維組、30%復合膳食纖維組的R7、R10、R9 獲得綜合評分的前三名。從這個排序也得到兩個啟示，第一，茶樹菇膳食纖維抗氧化效果表現突出；第二，食物中添加復合型的膳食纖維抗氧化效果會更好些，在30%添加量范圍內，添加總量越多抗氧化效果越好。

3 結論

本研究從廣西巴馬長壽人群飲食中分離所得的7 種代表性果蔬膳食纖維入手，設計了10 種膳食纖維飲食方式，并利用C57BL/6 小鼠比較了10 種膳食纖維飲食方式對機體氧化應激的改善作用。發現10 種膳食纖維飲食方式對C57BL/6 小鼠都具有一定的抗氧化作用，都能夠抑制機體內脂質過氧化產物Lip 和MDA的累積，提高抗氧化酶SOD，GHSPx 活力以及T-AOC 水平；綜合量化評價比較發現，茶樹菇膳食纖維抗氧化能力特別突出，食物中添加復合型的膳食纖維較添加單一膳食纖維效果更好，還發現在30%添加范圍內，膳食纖維添加總量越多，其抗氧化效果越好。本研究發現的這些特性，這不僅驗證巴馬長壽人群膳食中膳食纖維的抗氧化衰老作用效果，給巴馬長壽核心區飲食的益生效果提供了理論支持，也為有關個性化健康飲食的開發提供了一些新線索。