灌草凋落物混合添加對原油污染土壤修復效果的影響

張曉曦,周雯星,王麗潔,李江文,胡嘉偉,胡 漫

1 延安大學生命科學學院, 延安 716100 2 陜西省區域生物資源保育與利用工程技術研究中心, 延安 716100

陸地采油過程中,井噴事故、輸油管線破損以及廢水廢渣傾倒填埋已經導致采、運、煉制相關區域土壤被嚴重污染[1-2]。原油污染物對土壤理化環境的干擾、其毒性作用對植物和土壤生物生長的抑制以及對其群落結構和功能的改變往往使污染區土壤生態功能退化或喪失,導致生態系統穩定性降低或崩潰[3- 5]。此外,污染物中的多環芳烴等組分對人體也具有明顯的致癌、致畸和致突變效應[2]。鑒于原油污染的上述生態風險,如何去除原油污染物并恢復土壤受損生態功能歷來是環境科學和土壤科學研究的熱點問題之一。

生物修復是最有前景的油污土壤修復技術之一,其中,生物刺激技術通過改善土壤微生物的通氣、水分和養分環境促進土著微生物生長,以利用其降解潛力去除污染物,具有投資低、二次污染少以及幾乎不受污染程度限制等優勢[6-7]。大量研究表明,無機肥料和動植物有機廢物等均可作為刺激物大幅加速土壤污染物的降解[7- 11]。其中,植物殘體是近年來受到廣泛關注的生物刺激物之一[12- 14]。疏松殘體的輸入可改善土壤孔隙狀況,使微生物更易獲取氧氣,滿足其生長和好氣降解的需要[6-7]。同時,鑒于油污土壤往往處在氮磷限制狀態,植物殘體提供的養分可以顯著促進降解微生物的生長[7, 15]。此外,植物殘體釋放和轉化成的多種表面活性劑(如有機酸和腐殖酸)和共代謝底物(如可溶性糖、有機酸、酚類和黃酮)[16- 18]則可協助微生物吸收和降解吸附性、疏水性較強或毒性較大的大分子量芳烴和非烴類物質。

植物殘體的修復效果已經得到了大量研究的證實,且已有研究表明在相同使用條件下,對某些植物殘體進行炭化處理或配合肥料使用可以顯著強化其修復能力[8, 19]。然而,上述途徑需要額外的能源(獲取高溫)和材料(如肥料)成本,如何使用更為簡單的方式進一步提高其修復效果是殘體修復技術應用中需要考慮的問題。現有研究表明,不同植物殘體混合分解時往往產生顯著的非加和效應,且多數情況下將提高混合物總體的分解和養分釋放速率[20]。相應地,混合分解同樣將對土壤性質產生非加和影響,使植物殘體對土壤微生物和酶活性、養分狀況以及pH的影響顯著高于或低于基于單種植物殘體處理的預期(即協同效應或拮抗效應)[21-22]。鑒于上述性質均與原油污染物的降解密切相關,采用簡單的混合處理即有可能利用殘體混合分解對土壤性質的非加和影響進一步強化植物殘體的修復效果。

然而,現有研究多數集中于單種殘體的修復效果,少數關于混合殘體修復效應的研究也往往將其視為一個整體[23],極少關注不同殘體間在修復過程中的相互作用。鑒于污染區周邊易于獲取的野生植物往往以群落形式共存,以往研究是否忽視了不同植物殘體修復油污土壤時,彼此間的協同效應對修復效果的強化作用？抑或不同植物殘體間對土壤性質的影響是否存在拮抗效應,從而削弱了實際修復效果[24]？上述問題需要進一步研究。此外,植物殘體混合分解往往對不同土壤性質產生相異影響,使用混合殘體處理會否在強化污染物降解的同時劣化土壤生化性質,因而削弱整體的修復效果？上述問題也尚需加以研究驗證。因此,本文以我國陜北石油產區易于獲取的10種植物凋落物及其混合物為對象,通過室內模擬修復試驗評價其修復效果,以及不同凋落物混合處理油污土壤時其修復效應的相互影響。以期探索通過簡單混合處理強化凋落物修復油污土壤的可能性,并避免凋落物混合處理土壤時產生拮抗效應,削弱整體的修復效果。研究結果可為合理利用野生植物資源修復油污土壤提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究采樣區位于陜西省延安市延長縣(東經109°33′—110°30′,北緯36°14′—36°46′,海拔高度997—1731 m)嚴家灣。當地屬暖溫帶干旱大陸性季風氣候,年平均氣溫10.4℃,年平均降水量505.3 mm,集中于7—9月。年平均日照時數2397.3 h,≥10℃積溫3532.2℃,無霜期143—162 d。當地土壤為黃綿土,植被以灌草地為主。經在采油區所處范圍內網格式多點采樣實測,污染土壤中原油濃度介于11.44—44.72 g/kg之間。因土壤污染時間難以確定,老化效應、長期自然衰減、植物生長或凋落物輸入導致的污染物組成和結合形態的改變均顯著影響試驗結果,因此本文采用人工污染方式處理土樣,以排除上述因素產生的誤差。原油購自當地油井,其凝點為19.6℃,20℃時密度為0.881 g/cm3,含有51.22%的飽和烴、27.91%的芳香烴,其余為12.97%的膠質和7.24%的瀝青質以及其他物質。

于2018年10月末采集供試土樣和植物凋落物。土壤采集自油井附近坡地上部。采用重量法檢測確定土壤不含污染物后,在坡地上部荒地內不同位置隨機設置1 m×1 m樣方若干,采集其0—20 cm層土壤,充分混勻后過5 mm篩去除雜物,并采用四分法獲取足量土樣。部分土樣用于測定未污染土壤生化性質本底值、飽和持水量和實際含水量。其余經人工原油污染后部分用于檢測污染對土壤性質的具體影響,部分用于模擬修復試驗。同時,在未污染區采集表1所示10種植物的凋落物(草本植物為全部立枯體、灌木植物為凋落葉),在背陰處自然風干1個月后粉碎,過1 mm篩后備用,并采用常規方法測定其初始元素組成特征和與原油降解相關的代謝產物含量[25-26]。

表1 凋落物初始元素組成特征

表2 凋落物代謝產物初始含量

1.2 土壤污染及均質化處理

依據當地土壤原油污染的較低濃度11.44 g/kg(高濃度多集中于油井附近有限范圍,面積較小),本研究設置污染濃度為15 g/kg(干土),將原油與供試土壤依據上述濃度混合。處理時,將所有原油與部分土樣通過攪拌揉搓充分混勻后,將污染土壤與剩余土壤再次充分混合。為保證污染物在土壤中達到自然均質化,并能顯著影響土壤生化性質以衡量植物殘體的修復效果,污染土樣在背陰處進行15 d的自然均質化處理,以模擬近期發生污染的表層土壤。均質化15 d后,土壤中飽和烴、芳香烴和非烴類物質含量分別為(7.40±0.04) g/kg、(4.18±0.09) g/kg和(2.94±0.02) g/kg(原油總殘留率約96.8%)。

1.3 修復試驗

稱取前述污染土樣60份,每份500 g。其中3份作為自然衰減對照,其余57份污染土樣分別添加單種凋落物(10種)或混合凋落物粉末(9種),并充分混合。凋落物添加比例依據前期研究設置為2%(干質量比),其中混合凋落物處理中各植物種凋落物所占質量均分。混合凋落物組成如下：白羊草+杠柳+狼牙刺(白杠狼M1)、白羊草+狼牙刺(白狼M2)、達烏里胡枝子+鐵桿蒿(胡鐵M3)、達烏里胡枝子+阿爾泰狗娃花+黃蒿(胡狗黃M4)、鐵桿蒿+杠柳(鐵杠M5)、鐵桿蒿+狼牙刺(鐵狼M6)、沙棘+狼牙刺(沙狼M7)、杠柳+狼牙刺(杠狼M8)和鐵桿蒿+冰草+無芒雀麥+黃蒿(鐵冰無黃M9),均依據當地植物實際形成的群落組成設置。每個處理均制備3份土樣作為重復。

隨后,將每份處理樣品分別置入規格為：22 cm × 16.3 cm × 9 cm的PC材質培養缽中,根據土樣飽和持水量的50%與其實際含水量的差值(換算為質量差),撥開土壤逐層補充滅菌蒸餾水,隨后使用帶孔保鮮膜封口,以控制水分過快蒸發并為微生物提供空氣。處理后,將培養缽隨機單層擺放,置于溫度為20—25℃的環境中培養150 d終止(保證凋落物完全分解[11])。培養期內,每周稱量培養缽質量并依據失水量補充滅菌蒸餾水,維持濕度恒定。自然衰減土樣與凋落物處理土樣做相同處理。為模擬野外實際修復情況,培養過程中不再擾動土壤。

1.4 指標測定

培養完成后,預留部分鮮土測定氧化還原酶活性,其余土樣風干后過1 mm篩,用于測定其他指標。其中,土壤原油(Coil)殘留量采用二氯甲烷提取-重量法測定[27]。提取出的原油再次溶解后轉入活化硅膠氧化鋁層析柱,分別使用正己烷、二氯甲烷/正己烷混合物(v/v=2∶1)和甲醇洗脫分離其飽和烴(SHs)、芳香烴(AHs)和非烴類(NonHs)組分,采用重量法測定其殘留量[27]。土壤硝銨態氮(NO3-N和NH4-N)、有效磷(AP)和速效鉀(AK)含量分別采用氯化鉀浸提-靛酚藍比色法/紫外分光光度法、碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法以及乙酸銨浸提-火焰光度法測定[26]。土壤pH使用玻璃電極法測定(水土比為2.5∶1)。脲酶(Ure)、蔗糖酶(Suc)、堿性磷酸酶(APase)、多酚氧化酶(PPO)和脫氫酶(Deh)活性分別采用3,5-二硝基水楊酸比色法、靛酚藍比色法、磷酸苯二鈉比色法、鄰苯三酚比色法和三苯基四唑氯化物比色法測定,結果以單位時間(d)單位質量土樣(g)催化產生的水解或氧化產物(氨氮、葡萄糖、酚、紅紫棓精和甲臜)的質量(mg或μg)數表示。過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定,結果以單位質量干土(g)在單位時間(h)內催化后殘留的過氧化氫消耗0.01 mol/L高錳酸鉀溶液的mL數表示[28]。

1.5 混合處理效應判別依據

參照前人判斷混合凋落物處理非污染土壤時是否產生非加和影響的理論依據[22],假定不同凋落物對彼此的修復效果不存在相互影響,則可使用下述公式基于單種凋落物處理下測得的石油烴(組分)降解率和土壤指標值計算其在混合處理下的理論預測值PM：

PM=∑ri,j...×Oi,j...

式中ri,j….為每種凋落物在混合物中所占比例,Oi,j….為各種凋落物單獨處理時上述指標的測值。

將PM與混合凋落物處理后上述指標的實測值M對比時,如果在統計學意義上M>PM>Oi, j…,或Oi>M>PM>Oj,則均認為凋落物在混合處理土壤時可顯著強化彼此對特定土壤性質的修復效果(含對原油及其組分的降解能力)。其中前種情況的強化效果最佳,后種情況下,盡管混合物的修復效果較某一單種凋落物的修復效果較差,但其仍表現出一定的強化效應,在某些具有較強修復效果的凋落物可獲取量較小的情況下、或實際應用中能獲取的凋落物均為混合狀態時,可在一定程度上減少對凋落物的消耗,減少殘體修復技術對污染區周邊環境的破壞。當在統計學意義上M

1.6 統計分析

對于每個凋落物組合下不同處理(其中自然衰減和混合物處理的理論預測值也視為處理)間特定原油(組分)降解或土壤性質指標,在SPSS 23.0中作單因素方差分析(one-way ANOVA),多種比較采用Duncan′s新復極差法,顯著性檢驗水平為α=0.05。使用FDiversity軟件計算混合凋落物的化學多樣性指標(FAD2、FRic和FDis指數)。使用SIMCA 14.1軟件對混合凋落物的化學特性(含養分含量、化學計量比、代謝產物含量以及化學多樣性指標)與修復效果指標(原油及其組分降解率以及土壤生化指標數值)做偏最小二乘回歸分析(PLS regression)。每個修復指標對應的變量投影重要值VIP大于1的凋落物指標視為影響該指標修復效果的主要因素。繪圖使用SigmaPlot 14.5完成。

2 結果與分析

2.1 原油污染及自然衰減對土壤化學和生物學性質的影響

研究結果表明(表3),原油污染顯著降低土壤硝銨態氮和有效磷含量并抑制土壤蔗糖酶和脲酶活性,但同時顯著提高堿性磷酸酶和多酚氧化酶活性(P<0.05)。自然衰減未顯著改善污染土壤速效養分含量,反而導致銨態氮和有效磷含量進一步顯著降低(P<0.05),且同時顯著降低了污染土壤的pH(P<0.05)。除顯著提高污染土壤過氧化氫酶活性外(P<0.05),自然衰減對其他酶活性、特別是污染后受到顯著抑制的蔗糖酶和脲酶活性無顯著影響(P>0.05)。

2.2 混合處理對凋落物去除原油污染物效果的影響

150 d的自然衰減可在一定程度上降解原油(降解率為32.44%)及其組分,其中飽和烴的降解率(41.26%)顯著高于芳香烴和非烴物質(29.90%和14.20%,圖1)。單種凋落物處理均可顯著提高原油及其組分的降解率(P<0.05),混合添加時多數凋落物間產生非加和效應,使其促進污染物降解的效果顯著強于或弱于基于單種凋落物修復效果的預測值。其中,鐵杠或胡狗黃凋落物混合處理產生顯著協同效應(P<0.05),強化了對原油整體的降解效果。鐵杠、白杠狼、胡鐵或鐵冰無黃凋落物混合顯著強化了對飽和烴的降解效果(P<0.05)；白杠狼或胡狗黃凋落物混合顯著強化了對芳香烴的降解效果(P<0.05)；白杠狼、胡鐵或胡狗黃凋落物混合顯著強化了對非烴物質的降解效果(P<0.05)。而白狼、鐵狼或杠狼凋落物混合對原油及其各組分的降解則均產生顯著拮抗效應(P<0.05),削弱了對污染物的降解效果。

表3 石油污染及自然衰減對土壤生化性質的影響

圖1 凋落物處理后的原油及其組分降解率Fig.1 Degradation rates of crude oil and its components after litter treatments圖中數據為平均值±標準誤,混合預測值視為處理之一進行統計分析;B.i.: 白羊草Bothriochloa ischaemum; L.d.: 達烏里胡枝子Lespedeza davurica; A.g.: 鐵桿蒿Artemisia gmelinii; H.a.: 阿爾泰狗娃花Heteropappus altaicus; H.r.: 沙棘Hippophae rhamnoides; P.s.: 杠柳Periploca sepium; S.d.: 狼牙刺Sophora davidii; A.s.: 黃蒿Artemisia annua; A.c.: 冰草Agropyron cristatum; B.in.: 無芒雀麥Bromus inermis; NA：自然衰減 natural attenuation處理;M1—M9 分別為混合物(對應各子圖中所有單種凋落物的混合物)處理的降解率實測值，PM1—PM9 為混合物處理的預測值

2.3 混合處理對凋落物修復受損土壤性質效果的影響

單種凋落物處理普遍顯著提高了土壤速效養分含量(圖2),而不同凋落物混合添加時對土壤速效養分含量也存在非加和影響。其中,鐵冰無黃、鐵狼或沙狼凋落物混合顯著強化了對硝態氮的補充效果,而胡鐵、鐵杠、白杠狼、白狼、胡狗黃或杠狼凋落物混合則產生顯著拮抗效應(P<0.05),削弱補充效果；鐵狼凋落物混合顯著強化了對銨態氮的補充效果,而杠狼、鐵杠或沙狼凋落物混合則顯著削弱了對銨態氮的補充效果(P<0.05)；白狼或沙狼凋落物混合顯著強化了對有效磷的補充效果,而杠狼凋落物混合則顯著削弱了對有效磷的補充效果(P<0.05)；白狼、胡狗黃、鐵杠、沙狼、杠狼、鐵狼或鐵冰無黃凋落物混合顯著強化了對速效鉀的補充效果(P<0.05)。

圖2 凋落物處理后的土壤速效養分含量Fig.2 The content of soil available nutrients after litter treatments

較之自然衰減,多數單種凋落物處理均進一步顯著降低土壤pH(圖3,P<0.05)。凋落物混合后在多數情況下(胡狗黃、胡狼、鐵杠、鐵狼或杠狼凋落物混合)對彼此降低土壤pH的效果產生拮抗效應,使混合處理后土壤pH顯著高于單種凋落物或基于單種凋落物處理的預測值(P<0.05)。

圖3 凋落物處理后的土壤pHFig.3 Soil pH after litter treatments

較之自然衰減,多數單種凋落物處理顯著提高了污染土壤除多酚氧化酶外的酶活性(P<0.05,圖4)。白杠狼、白狼、鐵狼、沙狼、杠狼或鐵冰無黃凋落物混合顯著強化了對蔗糖酶活性的刺激效果,而胡鐵或鐵杠凋落物混合顯著削弱了對其的刺激效果(P<0.05)；鐵黃或鐵狼凋落物混合顯著強化了對脲酶活性的刺激效果,而胡鐵凋落物混合顯著削弱了對其的刺激效果(P<0.05)；白杠狼、白狼、沙狼或杠狼凋落物混合顯著強化了對磷酸酶活性的刺激效果,而鐵狗黃凋落物混合顯著削弱了對其的刺激效果(P<0.05)；鐵狼、鐵冰無黃、或鐵杠凋落物混合顯著強化了對過氧化氫酶活性的刺激效果(P<0.05)；白狼、鐵狼、杠狼或鐵冰無黃凋落物混合顯著強化了對脫氫酶活性的刺激效果,而胡鐵、胡狗黃或鐵杠凋落物混合顯著削弱了對其的刺激效果(P<0.05)；沙狼或鐵冰無黃凋落物混合顯著強化了對多酚氧化酶活性的刺激效果,而胡鐵凋落物混合顯著削弱了對其的刺激效果(P<0.05)。

圖4 凋落物處理下土壤酶活性Fig.4 The soil enzymatic activities after litter treatments

2.4 混合凋落物的修復效果與其化學組成特征的關系

根據偏最小二乘回歸分析結果(圖5),將混合凋落物視為一個整體時,其對污染物中烴類成分的去除效果與其磷、有機酸、總酚和黃酮含量及其化學多樣性存在正相關關系,而與其碳含量、碳磷比和氮磷比存在負相關關系；對非烴類污染物的修復效果則與其磷鉀含量顯著正相關,而與其氨基酸、萜類以及可溶性糖含量負相關。總體而言,混合凋落物對土壤速效氮磷鉀的補充與其對應養分含量正相關,而與萜類、有機酸、黃酮和酚類含量負相關；對酶活性的刺激作用與其氮、氨基酸和可溶性糖含量正相關,而與萜類、有機酸、黃酮和酚類含量以及碳氮比負相關；對pH的影響則與其化學多樣性和分異性正相關,而與氨基酸和可溶性糖等指標負相關。

圖5 影響混合凋落物修復效果的主要凋落物性質Fig.5 The dominant characteristics affecting the remediating effects of mixed litters以偏最小二乘回歸分析獲得的VIP值(VIP: Variable Importance in Projection變量投影重要性指標)表示;僅列出VIP值大于1的指標,空白柱代表正相關,灰色柱代表負相關。C: 碳含量 Content of C; N: 氮含量 Content of N; P: 磷含量 Content of P; K: 鉀含量 Content of K; CRN: 碳氮比 The ratio of C to N; CRP: 碳磷比 The ratio of C to P; NRP: 氮磷比 The ratio of N to P; phen: 多酚含量 Content of polyphenols; SS: 可溶性糖含量 Content of soluble saccharide; terp: 萜類含量 Content of terpenoids; AA: 氨基酸含量 Content of amino acids; flav: 黃酮含量 Content of flavonoids; Oac: 有機酸含量 Content of organic acids; FAD2: 功能性狀距離; FRic: 功能體積指數; FDis: 功能分散指數;未檢測出對過氧化氫酶有明顯影響的凋落物性質指標

3 討論

與前人研究結果一致[29],自然衰減處理下土壤中的土著降解菌可直接利用原油組分作為碳源[14, 30]使其含量出現明顯降低(圖1)。然而,微生物在降解原油時將消耗大量土壤氮磷,最終導致自身生長受限和自然衰減的停滯[31]。同時,部分芳香烴和非烴物質有限的生物可利用性也使污染物降解進一步受到限制[32]。較之自然衰減,多數凋落物處理顯著提高了原油、特別是其中芳香烴和非烴物質等的降解率,這與多項研究結果相似[10- 12]。其原因是凋落物源氮磷養分促進了降解菌的生長[12],且其釋放的有機酸促進了多環芳烴的解吸和溶解、提高其生物可利用性[12, 33],黃酮、酚類和萜類則可誘導氧化酶的分泌,輔助微生物通過共代謝途徑降解其無法直接利用的原油組分[16- 18, 33]。

與預期一致,部分混合形式顯著強化了凋落物對原油組分的去除能力(圖1)。偏最小二乘回歸分析表明,不同混合凋落物的FAD2指數與其降解原油及其飽和烴和芳香烴組分的能力具有明顯的正相關(圖5),而具體至某一個凋落物組合時,考慮到混合添加無法改變凋落物化學成分的絕對含量,出現協同強化效應主要應歸因于混合提高了凋落物總體的化學多樣性(根據FAD2指數的計算方法,混合物的化學多樣性必然高于單種凋落物)。這在一方面提供了多樣化的養分并調節了凋落物的碳氮磷比例,使其更有利于多種微生物生長及其對凋落物的快速分解,從而使大量養分和降解輔助物質在更短時間內得以釋放[34-35],在污染物老化前促進微生物對其的降解[12],進而提高原油及其組分的降解率。另一方面,混合添加凋落物也可以同時為原油降解菌提供多種有機無機養分和降解輔助物,從而解除降解菌生長、污染物生物可利用性和溶解或某些共代謝底物缺乏的限制,更有效地降解原油的各個組分。例如,達烏里胡枝子+阿爾泰狗娃花+黃蒿混合時,黃蒿凋落物含有更多的氮磷養分但C/N和C/P較高,而其余兩種凋落物的C/N和C/P較低(表1),其存在能夠調節混合物的分解和養分釋放速率,更有利于在短時間內為微生物降解污染物提供養分。同時,達烏里胡枝子可提供更多可溶性糖和有機酸、阿爾泰狗娃花可以提供更多萜類物質,而黃蒿凋落物則可提供更多酚類、黃酮和氨基酸類物質(表2),上述凋落物混合也有利于為微生物同時提供多種生物表面活性劑和共代謝底物,使混合物可通過多個途徑的相互配合加速污染物降解。因此即使混合后凋落物養分和代謝產物含量不變,其對芳香烴和非烴類物質的降解能力仍顯著高于預期值,甚至超過任一單種凋落物處理。此外,不同凋落物處理將誘導不同土壤微生物豐度的增加[36]。鑒于各種微生物產生的降解酶的種類有所不同,這種差異可能產生互補效應,使降解微生物可以同時降解不同原油組分[17],并相互配合催化污染物降解的各環節,因此避免高毒性或酸性中間產物積累導致的降解過程停滯或降解的不徹底。相反地,部分凋落物混合則產生顯著拮抗效應(如白羊草+狼牙刺和鐵桿蒿+狼牙刺等)。其可能原因是混合添加對凋落物化學多樣性的提高十分有限(胡狗黃混合凋落物的FAD2值為12.28,而白狼和鐵狼混合凋落物僅為1.81和3.49),促進分解的作用較弱。而由于上述混合物中狼牙刺的基質質量遠高于其他兩種凋落物(氮含量高、碳氮比低),較大的養分梯度意味著前者將在真菌作用下轉移大量氮素至白羊草和鐵桿蒿凋落物協助其分解,而后兩者在分解時更傾向于固定養分,導致混合物整體分解和養分釋放速率降低[27],削弱其促進降解微生物生長的效果。這與偏最小二乘回歸分析(圖5)發現混合物的修復效果與其多個基質質量指標具有顯著相關的結論類似,說明化學多樣性增加并非影響凋落物修復效果的唯一因素。此外,大量研究表明酚類、萜類、黃酮和有機酸等輔助降解物質往往同時具有抑制土壤酶活性的效果[37]。某些凋落物混合后,上述物質可能對分解酶產生協同抑制,導致凋落物養分釋放速率降低[37-38],部分掩蓋了其促進污染物去除的效果。

對于土壤生化性質而言,自然衰減不利于污染土壤速效養分含量的恢復,Sanni等[31]的研究指出污染物降解過程將大量消耗土壤中積蓄的養分,這也支持了本文結論。凋落物處理一方面直接補充了土壤速效氮磷鉀,其對污染物降解的促進也使土壤中轉化養分的微生物類群部分恢復,因此使土壤速效養分含量顯著提高[8, 39]。與前人關于凋落物混合處理對土壤養分產生非加和影響的結論一致[22],混合添加同樣使凋落物補充污染土壤速效養分的效果出現協同增強或拮抗削弱。由于本研究條件下凋落物能夠完全分解[11],但凋落物混合后能釋放的養分總量不變,因此其對土壤養分的非加和影響應歸因于混合處理影響了污染物的降解。某些凋落物混合處理后污染物的加速降解有利于提高土壤中參與養分轉化的微生物和相關基因(如nifH、narG和amoA)的豐度[39],從而使土壤中其他形態的氮磷養分向速效態轉化,導致混合凋落物處理后的速效養分顯著含量高于預測值或單種處理。但污染物加速降解同時意味著大量的養分損耗,其改善土壤養分狀況的具體結果取決于上述因素的綜合效應。此外,某些凋落物混合后妨礙污染物的降解,不利于養分轉化微生物的恢復,或其混合添加將導致土壤微生物的功能特性改變。例如本文相關結果表明白羊草+狼牙刺混合物處理后,重度污染土壤(45 g/kg)中參與反硝化過程的細菌豐度顯著提高,這也可能是導致混合添加削弱凋落物硝態氮補充能力的重要因素之一。自然衰減顯著降低了污染土壤的pH,而多數凋落物處理則導致其進一步降低,這與Alotaibi等[10]的研究結果一致。其原因是凋落物輸入加速了污染物降解,導致其酸性中間降解產物增多[4],且凋落物自身釋放的酸性產物也導致了土壤pH降低[10]。混合添加多數導致凋落物對土壤pH的影響呈拮抗結果,即使pH降低幅度較預測減小,但不同混合凋落物導致上述現象的途徑可能有所差異。例如對于鐵桿蒿+狼牙刺凋落物而言,混合產生的拮抗效應弱化了刺激污染物降解的效果(圖1),因此導致酸性中間產物減少。而對于達烏里胡枝子+阿爾泰狗娃花+黃蒿等混合而言,可能是其混合在加速污染物降解的同時增加了微生物的多樣性,促進了酸性中間產物的徹底降解,其具體原因尚需進一步研究加以分析。對土壤酶活性而言,自然衰減僅能提高過氧化氫酶活性,而多數凋落物處理對多種土壤酶活性均有刺激效果。這與前人研究結果一致[8, 11, 40],其原因首先是凋落物處理促進了微生物生長,且為其分泌酶提供了必要元素或前體物質(N、P和氨基酸等),因此使胞內酶和胞外酶的活性顯著提高[18]。同時,凋落物提供的糖類、蛋白質和多酚等底物也誘導微生物分泌特定的酶,因此提高測得的酶活性(例如萜類物質誘導雙加氧酶的產生[32])。與前人研究結果一致[22],混合處理導致凋落物對土壤酶活性的影響與預測結果通常也存在差異。出現協同效應可能是混合處理加速了污染物的降解,使其對微生物的抑制進一步解除,同時污染物的降解減少了其與酶活性位點的結合或其對底物的包裹,因此提高了酶活性[41]。此外,前述混合處理對土壤酸堿性的改善也有利于部分酶活性的提高。而拮抗抑制可能是由于加速了抑制酶活性物質的釋放[37],使微生物活性受到限制所致。

需要指出的是,前述關于混合添加對凋落物修復效果產生非加和影響的機理分析是基于單個凋落物組合而言的。對于不同混合物而言,其修復效果不僅僅取決于不同凋落物間修復效果的相互影響,且在相當程度上仍然受到凋落物總體基質質量的控制(圖5)。事實上,除較高的化學多樣性外,較高的凋落物磷、有機酸、總酚和黃酮含量和較高的可分解性(低碳含量和碳磷比)也是有利于原油及其組分的降解的重要因素,但高次生代謝物含量同時可能不利于土壤養分狀況和酶活性的恢復(圖5)。其機理已在前文討論[8, 12, 16- 18, 33, 37],此處不再贅述。僅需額外說明的是,混合物對非烴類物質的降解能力僅受其磷鉀含量(正相關)和可溶性糖、氨基酸等易利用碳源(負相關)控制,其原因應與其極難被微生物利用[42],因此有機酸、總酚和黃酮等對其分解的促進有限有關；而在易利用碳源含量較高時,生長基質比例的增加反而導致競爭性抑制[43],不利于最難分解的非烴類組分的降解。

本文僅著重討論了在污染區周邊可獲取的凋落物的修復能力有限時,是否可以通過選擇適宜的凋落物組合強化修復效果、減少對凋落物的消耗以避免過度干擾污染區周邊生態系統。抑或在可獲取的凋落物均具有較強的修復能力時,是否有必要在采集凋落物時通過一定手段分離不同種類凋落物,以避免其修復效應相互拮抗而降低修復效果。在具體實踐中,尚需結合凋落物形成具體混合形式時的總體基質質量(化學組成特征)對其修復效果進行預判,以期在合理范圍內達到凋落物用量最小、修復效果最大化的目的,并避免在強化凋落物降解原油污染物效果的同時削弱其恢復土壤生化性質的能力。

4 結論

單種凋落物處理普遍顯著提高了污染物降解率和土壤速效養分含量,且多數處理顯著提高了污染土壤中蔗糖酶、脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶的活性。混合添加對凋落物的修復效果產生顯著非加和影響。其中白羊草+杠柳+狼牙刺、胡枝子+鐵桿蒿、胡枝子+狗娃花+黃蒿或鐵桿蒿+杠柳凋落物混合對原油及其組分的降解呈顯著協同作用,使其降解率顯著高于任一單種處理或基于單種處理的預測值,但其同時拮抗削弱凋落物對土壤速效氮(特別是硝態氮)的補充作用及(或)酶活性(特別是蔗糖酶和脫氫酶)的刺激作用。在實際使用中,可通過上述混合形式強化凋落物對污染物的降解能力,但需配合其他修復手段改善污染土壤生化性質。白羊草+狼牙刺、鐵桿蒿+狼牙刺、杠柳+狼牙刺凋落物混合產生相反效果,在使用上述群落的凋落物作為生物刺激劑時,應注意對不同凋落物進行分離以避免削弱其修復效果。總體而言,添加多酚、黃酮、有機酸和磷含量高,碳含量和碳磷比低且化學多樣性更高的混合凋落物更有利于降解原油污染物,但同時可能不利于土壤養分狀況和酶活性的恢復。