基于網絡藥理學探討腎元顆粒治療糖尿病腎病的作用機制

萬亞琴 王小琴

1.湖北中醫藥大學中醫臨床醫學院，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫院腎內科，湖北武漢 430061

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是常見的微血管并發癥，是糖尿病（diabetes mellitus，DM）死亡主要原因，也是終末期腎臟疾病（end-stage renal disease，ESRD）最常見病因[1]。由于發病機制復雜，西醫在臨床上尚缺乏有效治療手段，而湖北省中醫院研制的腎元顆粒由黃芪、大黃、淫羊藿三味藥組成，針對DN“脾腎虧虛，濁毒內盛”病機，以“溫補脾腎、通腑泄濁”立法所創，在DN 治療中已取得了一定療效。

但由于缺乏有效研究方法，腎元顆粒分子機制難以闡明。網絡藥理學[2]是一門新興交叉學科，是綜合藥學和計算機等學科構建藥物作用靶點與疾病關系網絡，分析藥物作用機制的科學，目前在中藥配方研究中應用日益增多。基于此，本研究擬通過網絡藥理學方法，深入發掘腎元顆粒治療DN 的作用機制，為臨床腎元顆粒的廣泛應用打下理論基礎。

1 資料與方法

1.1 數據庫和軟件

檢索藥物成分和靶點數據庫：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）；檢索疾病靶點：GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank 等數據庫；構建蛋白互作網：STRING；繪制網絡圖：Cytoscape 3.7.2；下載與人類基因靶點名稱：Uniprot；Venn軟件繪制維恩圖；R語言及Bioconductor軟件作GO 生物學和KEGG 代謝通路富集分析。

1.2 腎元顆粒成分及預測靶點獲取

TCMSP 數據庫[3]是一款分析中藥有效成分、藥物與疾病作用靶點的綜合數據庫。利用TCMSP 數據庫找出黃芪、大黃、淫羊藿所有化學成分，根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL），對收集的化合物成分和靶點進行整理。在Uniprot數據庫下載注釋文件，對靶點進一步修正和轉換。

1.3 DN 疾病靶點基因檢索

GeneCards 是人類基因簡編，導航與關聯人類基因、疾病、蛋白質、細胞和生物途徑的數據庫；OMIM是基因和遺傳表型的存儲庫；PharmGKB 網站可提供各種藥理學領域信息，是從原始文獻注釋到基于遺傳信息調整藥物治療的指南；TTD 是疾病靶點調節的RNA 及目標蛋白數據庫；DrugBank 是疾病及靶點信息數據庫。本研究將“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”作為關鍵詞，挖掘上述五大數據庫，檢索DN 基因并取交集。

1.4 腎元顆粒治療DN 交集靶點基因篩選

運用R 語言聯合Venn 軟件，繪制腎元顆粒治療DN 交集靶點維恩圖，獲得兩者交集靶點基因。

1.5 腎元顆粒成分-交集靶點-疾病網絡的構建

采用Cytoscape 3.7.2 軟件將化合物成分及交集靶點導入，進行腎元顆粒成分-交集靶點-疾病網絡的構建。

1.6 蛋白互作網絡的構建及關鍵靶點篩選

運用STRING 在線數據庫（string-db.org）處理上傳的交集靶點蛋白，構建出蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡圖，圖形以png格式輸出。

將節點信息導入Cytoscape 3.7.2 中，繪制PPI 網絡，采用CytoNCA 拓撲屬性構建關鍵靶點蛋白拓撲圖。根據節點度值（degree）、中介中心度值（betweenness centrality，BC）對化合物成分和關鍵靶點篩選排序。

1.7 GO 生物學過程和KEGG 代謝通路富集分析

利用R 語言和Bioconductor 包，對關鍵靶點基因進行GO 生物功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析。

2 結果

2.1 腎元顆粒成分-預測靶點圖構建

運用TCMSP 數據庫，嚴格按照OB ≥30%和DL≥0.18 為篩查條件，收集到35 種藥物成分及相應預測靶點292 個，主要成分為槲皮素、7-O-甲基異丁香酚、山柰酚等。

2.2 腎元顆粒治療DN 交集靶點

檢索GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank五大數據庫，刪除重復項、沒有靶點成分及合并后，最終獲得439 個疾病靶點。疾病靶點與藥物預測靶點取交集，最終交集靶點獲得67 個。見圖1。

圖1 腎元顆粒治療DN 交集靶點維恩圖

2.3 腎元顆粒成分-交集靶點-疾病網絡

采用Cytoscape 3.7.2 軟件將化合物成分及交集靶點導入，進行網絡構建，共有188 個節點，477 條邊。見圖2。

圖2 腎元顆粒成分-交集靶點-疾病網絡圖

2.4 PPI 網絡構建及關鍵靶點篩選

將交集蛋白上傳至在線STRING 數據庫，獲得PPI網絡，設置置信度為0.9，剔除離散靶點，獲得55 個交集蛋白，采用CytoNCA 拓撲屬性構建關鍵靶點蛋白拓撲圖。見圖3～4。

圖3 腎元顆粒防治DN 交集蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

根據節點degree 和BC 值對化合物成分及交集靶點基因排序，前3 位化合物成分為槲皮素、7-O-甲基異丁香酚、山柰酚；關鍵靶點為蛋白激酶B、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。

2.5 GO 生物學過程和KEGG 代謝通路富集分析

2.5.1 GO 富集分析 GO 富集分析顯示，生物學過程主要涉及G 蛋白偶聯受體信號通路過程、調節血管直徑等過程；細胞成分主要涉及突觸前膜、后膜等；分子功能主要涉及G 蛋白偶聯胺受體、G 蛋白偶聯神經遞質受體等。見圖5（封三）。

圖4 腎元顆粒“交集蛋白-關鍵靶點”拓撲圖

圖5 關鍵靶點GO 生物學過程富集分析

2.5.2 KEGG 代謝通路富集分析 KEGG 代謝通路富集分析顯示，關鍵靶點涉及到刺激神經組織通路、PI3KAkt 通路、MAPK 通路等，腎元顆粒可通過多通路協調作用治療DN。見圖6（封四）。

圖6 關鍵靶點KEGG代謝通路富集分析

3 討論

DN 是DM 最嚴重并發癥，以腎小球肥大、基底膜增厚、細胞外基質積聚為特征，最終導致ESRD，影響患者生活及生存質量。近年來，本課題組在腎元顆粒治療DN 實驗室研究方面[3-10]已取得一定進展，但其具體療效機制仍不清楚。

本研究顯示腎元顆粒治療DN 主要成分是槲皮素、7-O-甲基異丁香酚、山柰酚等，關鍵靶點是蛋白激酶B、VEGFA 和EGFR 等。山柰酚[11-12]源于姜科植物山柰的根和莖，具有抗炎、抗氧化應激和改善DN 大鼠腎功能作用。槲皮素可發揮抗炎、抗氧化作用，促進DM 性傷口愈合，增強裂孔膜蛋白表達，改善足細胞損傷，減少蛋白尿，發揮抗DN 功能[13-14]。

蛋白激酶B[15-16]又稱AKT1，可抑制胰島素受體去磷酸化，調節葡萄糖轉運和儲存，參與機體炎癥反應，是細胞增殖和凋亡關鍵蛋白。VEGFA[17]是促血管生成關鍵細胞因子，在正常腎小球足細胞中高表達，維持腎小球內皮細胞基本信號，高糖誘導VEGFA 過度表達，腎小球基底膜通透性升高、進行性蛋白尿加重；研究表明[18]，山柰酚導致EGFR/P38 信號通路激活、P21表達上調，抑制腎臟癌細胞生長。

GO 生物學過程和KEGG 代謝通路富集分析表明：GPCR 信號通路是藥物靶點作用的重要通路[19]，與DN 有關GPCR 包括5-羥色胺2A 受體、血管緊張素Ⅱ受體等；PI3K-Akt 信號通路[20-21]是胰島素調控肝糖原生成的關鍵通路，胰島素抵抗及DM 發病都與該通路有關。研究證實[22]，PI3K-Akt 通路抑制，功能下調會導致DM 大鼠腎小管凋亡，而其通過調控腎組織中水通道蛋白-1 表達能改善DN 癥狀。MAPK 通路[23-25]作為細胞因子信號轉導中轉站，參與氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡過程。研究表明，抑制此通路可減輕巨噬細胞浸潤和炎癥介質釋放，減少蛋白尿，延緩DN進程。綜上，本研究預測結果與目前已知文獻報道基本吻合[26]，提示網絡藥理學篩選及預測具有一定科學性。

腎元顆粒以黃芪為君，溫補脾腎、利水消腫；淫羊藿為臣，補腎壯陽，專補命門之火；酒制大黃為佐使，味苦性寒，化瘀解毒、通腑泄濁。全方溫補脾腎，使脾司散精，腎司開闔；通腑泄濁使水濕、瘀血、濁毒等實邪排出體外，共奏溫補脾腎、通腑泄濁之力。

結合中醫理論綜合考量發現，本研究仍存在不足之處：①由于中西醫“腎”概念差異，腎元顆粒治療DN在藥物成分和靶點選擇方面可能存在區別；②中西醫劃分疾病階段標準差異，影響療效觀察。后續本課題將結合上述結果和前期研究數據，進行分子機制研究及臨床驗證。

綜上，本研究以網絡藥理學為基礎，探討了腎元顆粒治療DN 效果機制，闡明了中醫藥多通路、多靶點綜合干預可行性與治療特色，為后續臨床和實驗設計等提供一定理論依據。