基于網絡藥理學與分子對接技術探討補腎活血方治療多發性骨髓瘤的物質基礎與作用機制

周艷群 林玲云 陳本澍 王禮瓊 劉增慧

廣州中醫藥大學第一附屬醫院血液科，廣東廣州 510405

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是常見的惡性漿細胞增殖性疾病，是一種不可治愈的疾病，最終將復發[1]。從中醫方面尋求新思路、新方法越發得到重視。MM 屬于中醫學的“骨痹”范疇[2]。補腎活血方由桃仁、紅花、丹參、當歸、補骨脂、菟絲子、熟地黃、三七組成，該方是全國名老中醫丘和明在多年臨床經驗中總結出來的，主要用于腎虛血瘀型MM 患者。現代研究發現，補腎活血方在改善MM 患者骨痛癥狀、增強化療效果、增強免疫力[3]、保護腎功能[4]、改善骨代謝以護骨[5]等方面均發揮重要作用。基于前期研究基礎上，本研究運用網絡藥理學與分子對接方法，探索補腎活血方治療MM 的物質基礎與作用機制，為后續的臨床應用與實驗驗證提供依據。

1 資料與方法

1.1 補腎活血方的活性成分及靶點挖掘

以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為潛在活性成分的篩選條件[6]，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）中篩選出補腎活血方符合條件的活性成分。在PubChem 數據庫中檢索并收集每個活性成分的Canonical SMILES 結構式，并分別上傳至Swiss Target Prediction 數據庫，即可獲得與已知配體二維結構相似度精確的預測靶點[7]。

1.2 基因芯片獲取

在GEO 數據庫中，以“multiple myeloma”作為檢索詞，篩選出同時含有MM 和正常人骨髓樣本的人源基因芯片，文件編號：GSE113295，該芯片由12 例完全緩解MM 骨髓樣本和6 例正常樣本構成。

1.3 差異表達基因的獲取與篩選

采用GEO2R 從基因芯片中篩選MM 患者與正常人骨髓的差異表達基因。并以P <0.05、兩組間表達量的比值（logFC）>1.5[8]為條件，篩選出MM 組織與正常組織中顯著上下調的基因。

1.4 “活性成分-靶點”網絡的構建和分析

將補腎活血方所含活性成分、潛在治療靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，對網絡中節點的度值、介數以及接近中心性進行分析。

1.5 GO 生物過程及KEGG 通路富集分析

導入潛在靶蛋白的基因簡稱，通過DAVID 數據庫完成基因本體（gene ontology，GO）、京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析及圖形可視化，以P <0.05 和偽發現率（false discovery rate，FDR）<0.05 進行評估[9]。

1.6 分子對接驗證

運用AutoDock Vina 對關鍵基因所對應的靶蛋白與關鍵成分分別進行對接，結合能＜0 kJ/mol 提示活性成分可與靶點蛋白自發結合，結合能越低，表明活性成分與靶蛋白的結合力越強[10]，并對最佳結合構像進行可視化。

2 結果

2.1 MM 相關差異基因表達分析

通過對基因芯片GSE113295 進行分析，獲取MM患者骨髓與正常人骨髓的基因表達譜中明顯改變的基因共1380 個。

2.2 補腎活血湯有效活性成分篩選及靶點預測

以OB≥30%、DL≥0.18 為條件進行檢索，得到補腎活血湯中活性成分共97 個（表1）。活性成分預測到靶點7088 個。將7088 個靶點與1380 個差異表達基因取交集，剔除重復靶點后，獲得補腎活血湯治療MM 的潛在靶點98 個。

表1 補腎活血湯有效活性成分

2.3 “活性成分-靶點”網絡構建與分析

“活性成分-靶點”網絡中，有195 個節點（活性成分節點97 個、靶基因節點98 個）和756 條邊。結合相關文獻[8]與本研究需求，取度值、介數以及接近中心性這3 個參數排名前9 位的基因交集，所得到的即為關鍵基因，分別為TNF、PPARG、NPC1L1、NOS2、MAPK14、ESR1、CSNK2A1、CDC25C、BRAF；同法獲取關鍵活性成分，分別為Methylcimicifugoside_qt、beta-carotene、Pyrethrin Ⅱ、Baicalin [黃芩苷、Stigmasterol、Daucos terol（即Eleutheroside A）]、Corylifolinin。“活性成分-靶點”網絡圖見圖1，圖中圓形節點代表靶基因，三角形節點代表活性成分；節點顏色隨著度值漸變，節點顏色越深，表示節點度值越大；節點形狀隨介數值漸變，節點形狀越大，表示介數越大；節點標簽字體大小隨接近中心性值漸變，標簽字體越大，表示越接近中心網絡。

圖1 “活性成分-靶點”網絡

2.4 GO 及KEGG 富集分析結果

KEGG 通路富集分析發現，信號通路共16 條（P ＜0.05，FDR ＜0.05），主要涉及癌癥信號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號傳導通路、破骨細胞分化通路、TNF信號通路等。富集所得信號通路詳細信息見圖2（封四）。

圖2 京都基 因和基因組數據庫通路

2.5 分子對接驗證

7 個活性成分與9 個靶基因進行分子對接，對接結果提示靶蛋白與關鍵成分的結合能均≤-6.0 kJ/mol，其中結合能最低的2 種模式為Methylcimicifugoside_qt與MAPK14 結合（結合能為-15.1 kJ/mol），Methylcimicifugoside_qt與BRAF 結合（結合能為-13.3 kJ/mol），對以上2 種結合模式進行可視化，見圖3。

圖3 結合模式進行可視化

3 討論

系統生物學是從整體視角認識生物體的研究技術，網絡藥理學技術、基因組學等多組學聯合應用，與中醫藥“整體觀”研究思路不謀而合[11]。在開展名老中醫藥專家學術思想傳承研究時，除了師徒傳承模式外，系統生物學、計算生物學、藥理學等多學科的交叉，更有利于名老中醫藥專家學術思想的傳承與探索[12]。β-胡蘿卜素是源于紅花的有效活性成分，PPARG 是癌癥信號通路中的重要靶點蛋白，β-胡蘿卜素聯合羅格列酮能通過PPARG 依賴的信號通路，增強成骨細胞分化來維持骨代謝的正平衡[13]。本研究也發現，β-胡蘿卜素能夠通過對PPARG 的調控，參與破骨細胞分化信號通路，且分子對接結果提示，β-胡蘿卜素能夠與PPARG 良好結合。豆甾醇是補骨脂、當歸、紅花、三七、山藥、熟地黃的共有活性成分，國外學者[14]研究發現，豆甾醇可通過下調類風濕性關節炎大鼠NF-κB 信號通路的激活和p38MAPK 的表達，實現對類風濕性關節炎大鼠的骨關節保護作用，與本研究結果一致。黃芩苷是紅花、山藥的共有活性成分，具有抑制MM 細胞的增殖、侵襲和促進其凋亡的作用[15]。胡蘿卜苷是來自牛膝的活性成分，研究者發現胡蘿卜苷具有顯著促進成骨細胞增殖的作用，且呈明顯的劑量依賴關系[16]。對“活性成分-靶點-KEGG 通路”網絡分析，發現MAPK14、TNF、BRAF、PPARG、VEGFA、NOS2等關鍵基因是補腎活血方治療MM 的潛在靶基因。差異基因數據分析顯示，這些基因在MM 患者中是呈現出上調狀態；為了說明潛在作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，進行了GO 功能富集和KEGG 分析，發現這些靶基因可參與MAPK、NF-κB、破骨細胞活化、TNF、癌癥等信號通路。MAPK 信號通路是參與調控MM 細胞增殖的重要信號通路[17]，與骨代謝密切相關，廣泛參與了骨相關細胞的細胞內活動[18]。高水平BRAF 的表達，激活MAPK 信號通路[19]，刺激MM 細胞的增殖，阻止其凋亡[20]，并導致蛋白酶體抑制劑耐藥[21]。MAPK 還能夠通過影響NF-κB 信號通路介導骨質疏松癥的發展[22]，抑制NF-κB 信號通路，可抑制MM 細胞增殖[23]。TNF 作為常見的炎癥因子，在異常骨吸收患者中高表達，下調TNF 基因的表達，可減少TNF 的生成，減少破骨細胞的形成，抑制骨破壞[24]。

通過網絡藥理學分析顯示，補腎活血方可能以MAPK 信號通路為核心，以β-胡蘿卜素、豆甾醇、黃芩苷、胡蘿卜苷為物質基礎，通過NF-κB、破骨細胞分化、TNF 信號通路對MM 發揮抑制MM 細胞增殖、增強化療效果、減輕骨破壞作用，該結果有待進行下一步具體的實驗驗證。