虎杖苷對脂多糖介導的皮膚成纖維細胞焦亡的影響

陳白燁 陳敏健 王學明 宋湧 汪怡 袁曉野

福建省婦幼保健院整形外科，福州 350000

細胞焦亡是一種程序性細胞炎性死亡方式，各種刺激因子導致細胞半胱天冬酶-1（caspase-1）激活，一方面引起細胞膜破裂并釋放細胞內容物，進而激活炎性反應；另一方面促進白細胞介素（IL）-1β和IL-18的成熟及分泌，進而介導炎性反應［1］。而大量研究表明，炎癥是影響創面愈合的重要因素［2-3］，但細胞焦亡在創面愈合中的作用極少見報道，因此，在本研究中我們將探討皮膚成纖維細胞焦亡在創面愈合中的作用。

我們以往研究證實虎杖苷可以促進大鼠創面愈合［4］，但機制不清。有研究證實，虎杖苷可以抑制膿毒癥急性腎損傷中腎小管上皮細胞NLRP3（NACHT，LRR，and PYD domain-containing protein 3）炎性小體激活［5］，而NLRP3激活是誘導細胞焦亡的重要因子［6］。本研究推測虎杖苷可能通過抑制皮膚成纖維細胞焦亡促進創面愈合。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人皮膚成纖維細胞購于上海賽佰慷生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）細胞增殖檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。Ⅲ型膠原蛋白試劑盒購于美國ADL公司；caspase-1活性檢測試劑盒購于英國Abcam公司；IL-1β及IL-18酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于Abclonal生物科技有限公司；虎杖苷及Belnacasan（VX-765）購于美國Sigma公司。

1.2 細胞培養及分組 人皮膚成纖維細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃及5%CO2下培養，待細胞生長至融合度達80%以上后傳代。參照參考文獻［7］，以5μg/ml脂多糖（LPS）刺激人皮膚成纖維細胞建立實驗模型，培養72 h后檢測相關指標。細胞隨機分為4組：對照組細胞接受正常培養處理；實驗組細胞接受5μg/ml LPS處理；治療組細胞接受5μg/ml LPS及50μmol/L虎杖苷處理［8］；抑制劑組細胞接受5μg/ml LPS及100 nmol/L VX-765（caspase-1抑制劑）處理［9］。

1.3 caspase-1活性檢測 收集細胞并裂解，離心后取上清，以50μl樣本+50μl反應液+5μl底物建立反應體系，37℃避光孵育120 min后酶標儀檢測（激發波長400 nm，發射波長505 nm）。

1.4 炎癥因子檢測 采用IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒檢測，收集細胞培養液，離心后取上清，參照說明書方法步驟進行實驗，用酶標儀檢測讀數，并計算樣本濃度。

1.5 Ⅲ型膠原蛋白檢測 收集細胞并裂解，離心后取上清。根據試劑盒說明書步驟操作，充分顯色后酶標儀檢測490 nm吸光度值，并計算樣品濃度。

1.6 細胞增殖檢測 MTT法檢測細胞增殖，細胞接種于96孔板中，按實驗設計處理細胞后，每孔加入10μl MTT（5 mg/ml），37℃繼續培養4 h，棄液洗3次后，每孔加入100μl二甲基亞砜，10 min后酶標儀檢測490 nm吸光度值。

1.7 統計學處理 應用SPSS20.0軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD多重比較法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 虎杖苷及VX-765對成纖維細胞焦亡的影響 由表1可見，與對照組比較，實驗組細胞caspase-1活性，培養液IL-1β及IL-18含量顯著增加（均P＜0.05），提示細胞焦亡激活；與實驗組比較，治療組及抑制劑組細胞caspase-1活性，培養液IL-1β及IL-18含量顯著下降（均P＜0.05），提示虎杖苷及VX-765均可以抑制LPS誘導的成纖維細胞焦亡。

表1 各組成纖維細胞焦亡檢測（±s）

表1 各組成纖維細胞焦亡檢測（±s）

注：對照組細胞不接受任何處理，實驗組細胞接受5μg/ml脂多糖（LPS）處理，治療組細胞接受5μg/ml LPS及50μmol/L虎杖苷處理，抑制劑組細胞接受5μg/ml LPS及100 nmol/L VX-765處理；與對照組比較，a P＜0.05，與實驗組比較，b P＜0.05

組別對照組實驗組治療組抑制劑組caspase-1活性（%）100.0±6.4 475.4±39.9a 292.1±28.5ab 185.5±16.1ab IL-1β（pg/ml）29.3±2.5 254.9±19.4a 167.5±11.8ab 127.4±16.5ab IL-18（pg/ml）19.3±2.5 212.6±22.4a 165.5±19.9ab 129.5±17.2ab

2.2 虎杖苷及VX-765對成纖維細胞增殖及Ⅲ型膠原蛋白分泌的影響 由表2可見，與對照組比較，實驗組細胞增殖及培養液Ⅲ型膠原蛋白含量顯著下降（均P＜0.05）；與實驗組比較，治療組及抑制劑組細胞增殖及培養液Ⅲ型膠原蛋白含量顯著增加（均P＜0.05），提示虎杖苷通過抑制細胞焦亡，促進成纖維細胞增殖及分泌Ⅲ型膠原蛋白。

表2 各組成纖維細胞增殖及Ⅲ型膠原蛋白檢測（±s）

表2 各組成纖維細胞增殖及Ⅲ型膠原蛋白檢測（±s）

注：對照組細胞不接受任何處理，實驗組細胞接受5μg/ml脂多糖（LPS）處理，治療組細胞接受5μg/ml LPS及50μmol/L虎杖苷處理，抑制劑組細胞接受5μg/ml LPS及100 nmol/L VX-765處理；與對照組比較，a P＜0.05，與實驗組比較，b P＜0.05

組別對照組實驗組治療組抑制劑組細胞增殖（%）100.0±2.3 72.5±3.4a 86.8±5.5ab 83.1±7.7abⅢ型膠原蛋白（μg/L）0.12±0.02 0.06±0.01a 0.10±0.02ab 0.09±0.01ab

3 討 論

細胞焦亡是一種程序性細胞死亡，也叫細胞炎性壞死，主要依賴于炎性小體的激活，包括NLRP1、NLRP3、AIM2等；活化的炎性小體通過激活caspase家族蛋白，進而切割并活化gasdermin蛋白；活化的gasdermin蛋白在細胞膜形成孔道，導致細胞內外通透性失衡，細胞不斷腫脹并破裂，進而釋放其細胞內容物，介導過度的炎性反應［10-11］。研究表明，細胞焦亡主要分為經典途徑（依賴caspase-1）和非經 典 途 徑（依 賴caspase-4/5/11）［12］。在 經 典 途 徑 中，caspase-1被炎性小體激活后通過切割gasdermin-D（GSDMD）介導細胞焦亡，并促進IL-1β和IL-18的成熟和分泌，擴大炎性反應。在非經典途徑中，caspase-4/5/11直接被細胞損傷相關分子模式（DAMPs）活化，切割并活化GSDMD，進而介導細胞焦亡。

越來越多的研究表明，細胞焦亡通過調節炎性反應參與創傷、感染、退行性病變等多種疾病［10，13-14］，但其在創面愈合中的作用尚未見研究報道。鑒于細胞焦亡在炎癥調節中的重要作用，而過度的炎性反應是導致創面延遲愈合及不愈合的重要因素，因此，我們推測細胞焦亡參與了創面愈合的過程。本研究中通過LPS刺激成纖維細胞模擬創面愈合的炎癥過程，這是參照了許多其他的類似研究［15］。我們發現LPS刺激介導成纖維細胞caspase-1激活，IL-1β和IL-18分泌增加，提示在創面愈合中存在細胞焦亡的激活。進一步為了探討細胞焦亡在其中的作用，我們通過caspase-1抑制劑VX-765抑制細胞焦亡，發現抑制細胞焦亡可以促進成纖維細胞的增殖。而研究證實，成纖維細胞在創面愈合中發揮關鍵作用，其細胞死亡或凋亡可以導致創面延遲愈合或不愈合［16］，而提高成纖維細胞數量可以促進創面愈合［17］。成纖維細胞通過分泌膠原蛋白促進創面愈合，本研究進一步證實抑制細胞焦亡可以促進成纖維細胞分泌Ⅲ型膠原蛋白。因此，本研究結果提示，抑制成纖維細胞焦亡可能促進創面愈合。

我們既往已證實虎杖苷可以促進大鼠創面愈合［4］，但機制不清。研究證實，虎杖苷可以抑制膿毒癥急性腎損傷中NLRP3炎性小體激活，而NLRP3炎性小體激活是介導細胞焦亡的重要途徑［5］。因此，本研究推測虎杖苷可能通過抑制細胞焦亡發揮作用。本研究結果證實虎杖苷可以抑制LPS誘導的成纖維細胞焦亡，并促進其增殖并分泌膠原蛋白，提示虎杖苷可能通過抑制成纖維細胞焦亡促進創面愈合。

綜上，抑制LPS誘導的成纖維細胞焦亡可以促進其增殖并分泌膠原蛋白，虎杖苷可能通過抑制成纖維細胞焦亡促進創面愈合。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。