分子標(biāo)記物BLM 聯(lián)合超聲在乳腺癌診斷中的價值研究

劉秀祥，陳毅作

全球乳腺癌病例占惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的11.6%，而乳腺癌的死亡率占惡性腫瘤死亡病例數(shù)的6.6%[1]。乳腺癌早期癥狀不典型，因此提高乳腺癌的檢出率顯得尤為重要[2]。Bloom 解旋酶（BLM）是一種乳腺癌易感基因，參與DNA解螺旋及DNA損傷修復(fù)等過程，在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，與乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤耐藥等過程密切相關(guān)[3]。與CT 診斷和MRI診斷相比，超聲具有敏感性高、操作簡便、無輻射和動態(tài)觀察腫瘤病灶等優(yōu)點[4]。隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，超聲能夠有效反映腫瘤血流動力學(xué)及腫瘤形態(tài)，但是在診斷敏感性和成像分辨率上仍然存在一定局限性，將超聲成像技術(shù)聯(lián)合生化指標(biāo)應(yīng)用于乳腺癌診斷逐漸得到廣泛關(guān)注。本研究探討血清BLM 聯(lián)合超聲在乳腺癌診斷中的價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年3 月至2021 年3 月浙江省溫州市人民醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院共同收治的40 例乳腺癌患者作為觀察組。年齡38～65 歲，平均（50.8±11.3）歲；平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（20.56±2.11）kg/m2。腫瘤類型：原位癌18例，浸潤性導(dǎo)管癌14例，浸潤性小葉癌5 例和腺癌3 例。選擇同期診治的40 例乳腺良性腫瘤患者作為對照組，年齡40 ～65 歲，平均（51.1±12.7）歲；平均BMI（21.09±2.13）kg/m2。腫瘤類型：纖維腺瘤17 例，乳腺大導(dǎo)管乳頭狀瘤8 例，乳腺囊性增生瘤10 例，乳腺囊性脂肪瘤5 例。兩組上述資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）。患者或家屬均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)診斷為乳腺癌；（2）入院前無放化療治療史；（3）非乳腺癌復(fù)發(fā)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他類型腫瘤；（2）入院前3 個月內(nèi)有外科手術(shù)史。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料、試劑及儀器 引物和質(zhì)粒均購自蘇州金唯智生物科技有限公司，mirVanaTMmiRNA 提取試劑盒（貨號：AM1560）和高容量RNA-to-cDNA試劑盒（貨號：4387406）購自美國賽默飛世爾科技有限公司，SYBR Green RNA熒光定量PCR 試劑盒（貨號：WH0125）購自北京百奧萊博科技有限公司，EDTA-2K管（貨號：R10128）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，化學(xué)發(fā)光分析儀（型號：C411）購自瑞士羅氏cobas 科技有限公司，超聲診斷儀（型號：LOGIQ E9）購自美國GE 科技有限公司。

1.2.2 血清BLM 蛋白和BLM-mRNA水平檢測 患者入院后使用EDTA-2K管采集2 ml全血，于室溫靜置30 min后3 500 r/min 離心10 min。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清BLM蛋白水平，使用化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑盒進(jìn)行檢測，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。BLM 蛋白正常值1 ～4 ng/ml。采用實時熒光定量PCR 法檢測血清BLMmRNA 水平。使用mirVanaTMmiRNA 提取試劑盒提取總RNA，采用高容量RNA-to-cDNA 試劑盒對mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系：2×RT buffermix10 l，20×RT Enzyme mix 1 l，RNA 9 l。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃60 min，95 ℃5 min。采用SYBR Green RNA 熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，熒光定量反應(yīng)體系為SYBR mix 10 l，正向引物0.2 l，反向引物0.2 l，DNA 模板2.6 l，雙蒸水7 l，總體系20 l。PCR 擴(kuò)增采用兩步法擴(kuò)增，程序如下：95℃20min，95℃15s，60℃35s，35 個循環(huán)。BLM 正向引物：5’- GCAGCGACAGT-GCGAGCT-3’，BLM 反向引物：5’- TCCGAGTGAGTTAGGAAG-3’。內(nèi)參基因選擇16SrRNA 基因，正向引物：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGC ACATATAC-3’，反向引物：5’-CCTGGCGTCGTGCTTAGTGAT-3’。根據(jù)2－△△Ct法計算BLM 的相對表達(dá)量。

1.2.3 乳腺超聲檢測 采用GE LOGIQ E9 超聲診斷儀，ML6-15 線陣探頭。乳腺造影設(shè)置，脈沖反相諧波成像技術(shù)，機(jī)械指數(shù)調(diào)節(jié)至0.07，造影總增益設(shè)置為70%，深度2.5 cm，單點聚焦置于圖像最深部。對比劑為SonoVue。常規(guī)超聲顯示腫瘤，選取最大切面，調(diào)節(jié)圖像至最佳，切換入超聲造影模式，保持最大切面不變，連續(xù)實時觀察病灶動態(tài)灌注過程3 min。BI-RADS 分級：0 級，超聲結(jié)果未顯異常，需結(jié)合其他類型檢查結(jié)果進(jìn)行綜合評估；1 級，未有異常變化，基本判定為正常；2 級，基本能夠排除惡性腫瘤，為良性征象；3 級，良性病變征象；4級，可疑惡性，需進(jìn)一步穿刺進(jìn)行病理學(xué)檢查；5 級，可疑惡性；6 級，已經(jīng)病理學(xué)診斷確診為惡性腫瘤[5]。

1.3 觀察指標(biāo) 兩組血清BLM蛋白和BLM-mRNA 水平，超聲、血清BLM 蛋白單獨及聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)，其中特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%，敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，陽性預(yù)測值=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%，陰性預(yù)測值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%，約登系數(shù)=敏感度+特異度―1[6]。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t 檢驗，多組比較采用方差分析；計數(shù)資料比較采用檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson法分析；診斷價值分析采用受試者工作特征曲線（ROC）。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清BLM 蛋白和BLMmRNA 水平比較 觀察組血清BLM 蛋白和BLM-mRNA 水平均高于對照組（均P ＜0.05），見表1。

表1 兩組血清BLM 蛋白和BLM-mRNA水平比較

2.2 BI-RADS 分級與血清BLM 蛋白的相關(guān)性分析BI-RADS分級與血清BLM蛋白水平呈正相關(guān)性（r=0.9081，P ＜0.05）。

2.3 超聲、BLM蛋白單獨及聯(lián)合診斷乳腺癌與病理診斷結(jié)果比較 超聲、BLM蛋白聯(lián)合診斷乳腺癌的診斷符合率為92.50%，高于超聲、BLM 蛋白單獨檢測的72.50%和65.00%（=12.331、15.732，均P ＜0.05）。見表2。

表2 超聲、BLM 蛋白單獨及聯(lián)合診斷乳腺癌與病理診斷結(jié)果比較 例

2.4 超聲、BLM蛋白單獨及聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)比較 超聲和BLM蛋白聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)均高于超聲和BLM蛋白單獨檢測（均P ＜0.05），見表3。

表3 超聲、BLM 蛋白單獨及聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)比較

2.5 超聲、BLM 蛋白單獨及聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷價值分析 超聲和BLM 蛋白單獨及聯(lián)合判斷乳腺癌的AUC值分別為0.814、0.830 和0.913，漸進(jìn)95% CI 分別為0.749 ～0.879、0.768～0.891、0.868 ～0.958。見圖1。

圖1 超聲、BLM 蛋白單獨及聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷價值分析

3 討論

乳腺癌是目前排名第一的女性惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年增長趨勢[7]。提高乳腺癌的早期檢出率是目前乳腺癌臨床診斷和治療的工作重點之一。有研究報道在乳腺癌患者中腫瘤血清標(biāo)志物水平異常的發(fā)生要早于臨床癥狀出現(xiàn)[8]，因此檢測腫瘤血清標(biāo)志物的表達(dá)水平可作為乳腺癌早期診斷的方法之一。

BLM是RecQ蛋白家族的重要成員之一，在DNA 修復(fù)、重組及復(fù)制等細(xì)胞過程中均起到重要調(diào)節(jié)作用[9]。有研究報道多數(shù)乳腺癌患者有BLM 的高度表達(dá)，是檢測乳腺癌的重要腫瘤標(biāo)志物[10]。本研究也顯示乳腺癌患者的血清BLM水平異常上調(diào)，且與BI-RADS 分級呈正相關(guān)，表明BLM水平升高與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。分析其原因可能是由于BLM 基因存在堿基突變所致[11]。

腫瘤標(biāo)志物的單項檢測對惡性腫瘤的診斷效能較低，主要是由于可以在多種腫瘤中檢測到同種腫瘤血清標(biāo)志物的表達(dá)異常，且同種惡性腫瘤中存在眾多腫瘤血清標(biāo)志物的表達(dá)異常[12]。有研究報道在乳腺良性病變患者中BLM 水平可有不同程度的提高[13]。因此將多種診斷方法聯(lián)合應(yīng)用，在乳腺癌的早期診斷中具有重要的臨床價值。超聲對于腫塊的細(xì)微結(jié)構(gòu)，如是否存在毛刺、腫塊實質(zhì)是否存在鈣化及腫塊邊緣的光整程度等均能夠顯示清晰。本研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合血清BLM 檢測的異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值、約登系數(shù)和AUC 值均高于單獨檢測。分析其原因可能是由于超聲聯(lián)合血清BLM 檢測能夠彌補單一指標(biāo)檢測的不足，使得乳腺癌的診斷正確率得以提高。

綜上所述，乳腺癌患者的血清BLM水平異常上升，超聲聯(lián)合血清BLM檢測在乳腺癌的診斷中具有較高的臨床價值。但本研究的臨床樣本較少，有待擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步驗證。