非小細胞肺癌組織中PDHA1、GBP1 的表達及臨床意義

李豐環 康麗君

山東省煙臺市煙臺山醫院呼吸與危重癥醫學科，山東煙臺 264000

肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要亞型，占所有肺癌病例的85%[1-2]。NSCLC 早期臨床癥狀并不明顯，大多數患者在診斷時已進入晚期，嚴重影響其預后，因此闡明NSCLC 的潛在機制對改善患者的不良預后極為重要。丙酮酸脫氫酶復合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDHc）存在于線粒體中，是細胞有氧氧化過程中重要的調控位點[3]。PDHcE1α亞單位（PDHcE1α subunit，PDHA1）是PDHc 的活性位點，PDHc 的磷酸化和去磷酸化可調節其活性，進而調節細胞代謝過程[4]。有研究表明，當敲低食管癌組織中PDHA1 的表達時，可引起瓦爾堡效應，增強腫瘤細胞的遷移能力和對化療藥物的耐藥性[5]。鳥苷酸結合蛋白1（guanylate binding protein 1，GBP1）屬于GTP酶超家族，正常人皮膚及組織中不表達GBP1，當GBP1 表達升高時，表明可能有炎癥反應的發生[6]。據報道[7-8]，GBP1 可調節口腔鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲，但具體生物學機制尚不清楚。因此，本研究旨在分析NSCLC 組織中PDHA1 與GBP1 的表達及其與預后的關系，為臨床治療提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2017 年10 月山東省煙臺市煙臺山醫院收治的84 例NSCLC 患者作為研究對象。納入標準：①經活檢病理或術后病理檢查明確診斷為NSCLC。②均為首次診斷NSCLC，未接受放化療。③臨床病理資料完整并接受隨訪，且均通過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。排除標準：①患有同系統其他相關疾病，如肺炎、支氣管炎等。②重要臟器疾病，如冠心病、肝硬化等。③患有其他系統疾病或者惡性腫瘤，如胃癌、結腸癌等。從患者出院日起，每1～3 個月隨訪1 次，包括門診隨訪或電話隨訪，隨訪時間共36 個月，隨訪截至2020 年10 月或患者死亡，收集患者生存數據。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

采用免疫組織化學技術檢測NSCLC 癌組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣大于5 cm 的癌旁正常組織）PDHA1 與GBP1 的表達情況，將取出的癌組織及癌旁組織置于凍存管中，-70℃保存。①將組織甲醛固定后石蠟包埋、切片，將切片恒溫烘烤30 min。②依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，無水乙醇中水化15 min，磷酸鹽緩沖液清洗3 次，5 min/次。③將切片放入盛有枸櫞酸緩沖液的容器中，加熱至100℃10 min，冷卻清洗，再浸入3%H2O2室溫孵育20 min，清洗。④分別滴加100 μl PDHA1 和GBP1 一抗（稀釋比例1∶300，購自美國Abcam 公司，批號：20160102），4℃冰箱冷藏過夜，次日取出清洗，滴加100 μl PDHA1 和GBP1 二抗（稀釋比例1∶300，購自美國Abcam 公司，批號：20151209），室溫放置30 min，清洗。⑤滴加辣根過氧化物酶，室溫放置30 min 后清洗。⑥DAB 顯色5 min，流水沖洗，蘇木精復染，流水沖洗后封片，染色方法為酶標聚合物法，PDHA1 與GBP1 主要表達于細胞漿中，由專業病理科醫師進行顯微鏡鏡檢（400×），觀察10 個高倍視野，共計數100 個細胞，根據細胞的染色強度和細胞陽性百分率綜合計算分數。未著色記為0 分，淺黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，棕褐色記為3 分；細胞陽性率≤5%0 分，＞5%～25%1 分，＞25%～50%2 分，＞50%～100%為3 分，根據以上兩項結果得分相乘，0～3 分視為陰性，＞3 分為陽性[8]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 對所得數據進行統計學分析，計數資料采用例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier 繪制生存曲線，采用Long-rank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 患者癌組織及癌旁組織中PDHA1 與GBP1 的表達比較

NSCLC 患者癌組織及癌旁組織中PDHA1 與GBP1的表達情況見圖1～2（封四）。NSCLC 患者癌組織中PDHA1 陽性率為35.71%（30/84），癌旁組織中PDHA1 陽性率為63.10%（53/84），差異有統計學意義（χ2=12.597，P ＜0.001）。癌組織中GBP1 陽性表達率為69.05%（58/84），癌旁組織中GBP1 陽性表達率為30.95%（26/84），差異有統計學意義（χ2=24.381，P ＜0.001）。

圖1 非小細胞肺癌患者癌組織及癌旁組織中PDHA1的表達

圖2 非小細胞肺癌患者癌組織及癌旁組織中GBP1的表達

2.2 NSCLC 組織中PDHA1 和GBP1 的表達情況與患者預后的關系

84 例NSCLC 患者均隨訪成功，無失訪病例。隨訪3 年內，共有31 例死亡。PDHA1 陽性組死亡6 例，3 年生存率為80.00%（24/30），PDHA1 陰性組死亡25 例，3 年生存率為53.70%（29/54）。PDHA1 陽性組3 年生存率高于PDHA1 陰性組，差異有統計學意義（χ2=6.274，P=0.029）。見圖3。GBP1 陽性組死亡24 例，3 年生存率為58.62%（34/58），陰性組死亡7 例，3 年生存率為73.08%（19/26），GBP1 陽性組3 年生存率低于GBP1 陰性組，差異有統計學意義（χ2=5.231，P=0.036）。見圖4。

圖3 PDHA1 陽性組與PDHA1 陰性組的生存曲線

圖4 GBP1 陽性組與GBP1 陰性組的生存曲線

3 討論

NSCLC 是呼吸系統常見的惡性腫瘤之一，好發于有吸煙史及有家族史者，根據NSCLC 病理分型，可將其分為鱗癌、腺癌、大細胞癌、腺鱗癌和唾液腺型腫瘤[9-10]。NSCLC 常見的臨床癥狀有咳嗽、咯血、呼吸困難及胸痛等，到晚期可合并其他系統疾病，如病理性骨折[11]。NSCLC 的主要治療手段包括手術切除、放療、化療及靶向治療等[12-13]。NSCLC通常在早期已發生轉移，且預后較差，盡管目前醫療技術得到了很大程度的提升，但晚期NSCLC 患者的預后及生存情況仍不容樂觀。因此，研究NSCLC 發生發展的分子生物學機制顯得尤為重要。

PDHc 是細胞代謝過程中重要的限速酶之一，可在細胞代謝過程中供給能量，有助于細胞的生長發育[14-15]。PDHA1 基因位置為Xp22.12，全長約17.5 kb，由12 個外顯子組成，編碼長度約為390 個氨基酸肽鏈。PDHA1是PDHc 的活性調控位點，PDHA1 的表達狀態影響著PDHc 的活性，如敲低PDHA1 的表達可使得PDHc失活并減緩細胞生長過程[16]。PDHA1 蛋白在多種疾病中下調，如癲癇、亞急性壞死性腦脊髓病等[17-18]。有研究顯示，低表達的PDHA1 與卵巢癌的預后不良相關，PDHA1 可通過影響細胞代謝過程、基因突變進而參與腫瘤的惡性進展過程[19]。本研究結果顯示，PDHA1在NSCLC 患者組織中表達下調，相關文獻顯示，PDHA1表達降低時會導致細胞內的活性氧水平降低，上調絲氨酸/蘇氨酸Akt 激酶的表達并進一步激活大腦皮質缺血周圍區磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt 激酶信號通路，該通路的激活促進了細胞周期蛋白D1 的表達，從而加快了細胞的生長周期，減少細胞凋亡，對腫瘤細胞的生長分化起到了促進作用，提高了腫瘤的臨床分期，增加了腫瘤的惡性程度[20]。另一方面，PDHA1 的低表達使PDHc 的活性降低，導致線粒體氧化磷酸化水平下降，糖酵解增加，促進腫瘤的發生發展過程[21]。

GBP1 屬于GTP 酶家族，基因位于X 染色體上，由GTP 酶活性區、效應區及鏈接二者的中間結構組成[22]。相關文獻顯示，GBP1 可抑制水皰型口炎病毒及腦心肌炎病毒的復制，當敲低GBP1 的表達時，病毒的復制卻明顯增強[23]；過表達的GBP1 可刺激表皮生長因子受體通路與p53 信號通路的表達，進而誘導食管癌細胞的淋巴轉移，并與食管癌的不良預后相關[24]。但GBP1 在NSCLC 發生發展中的作用機制尚不清楚。本研究結果顯示，GBP1 在NSCLC 組織中表達上調，提示GBP1 可能參與了NSCLC 的發生發展過程。相關研究結果顯示，Wnt 基因已被鑒定為癌基因，Wnt/β-連環蛋白信號通路通過調控胚胎發育、細胞增殖及分化過程，進而在惡性腫瘤的發生中起著極其重要的促進作用[24-26]，高表達的GBP1 可激活該通路中β-連環蛋白的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、分化及浸潤，對腫瘤的發展過程起到了促進作用。此外，高表達的GBP1 還可通過介導γ 干擾素對腫瘤細胞的凋亡起到抑制作用，加快腫瘤的癌變進展[4]。本研究中PDHA1陽性組3 年生存率高于PDHA1 陰性組，GBP1 陽性組患者3 年生存率低于GBP1 陰性組，提示PDHA1 與GBP1 可能與NSCLC 患者的預后相關。

綜上所述，NSCLC 組織中PDHA1 和GBP1 表達異常，二者有望成為新的NSCLC 預后評估的分子標志物。但二者在NSCLC 的發生發展過程中的具體作用機制還需要大樣本量的研究來深入探索。