華蟾素對Wnt/β-catenin通路抑制腎癌細胞增殖及侵襲的影響*

吳瀟蕓,鄭盛鋒,張明津,付偉金△

1廣西衛生職業技術學院(廣西南寧 530023)；2廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科(廣西南寧 530022)

華蟾素(bufalin)是傳統中藥蟾蜍皮膚中提取的有效成分，是一種類地高辛類物質[1]。研究證實華蟾素可促進胃癌、肝癌、結腸癌等多種腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖及細胞侵襲性，發揮抗腫瘤活性[2-4]。近年發現華蟾素不僅抑制泌尿系腫瘤中如膀胱癌、前列腺癌細胞增殖[5-6]，還可抑制腎癌細胞增殖和侵襲[7]，但具體機制仍有待進一步研究。Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路已被證實與腫瘤細胞的增殖和侵襲密切相關。Gai等[8]證實華蟾素可下調Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達，從而抑制肝癌細胞侵襲和遷移。目前不清楚華蟾素抑制腎癌細胞增殖和侵襲，是否與調控Wnt /β-catenin信號通路相關蛋白表達有關。本研究開展于2019年1—12月，擬探討華蟾素抑制腎癌細胞侵襲和增殖可能相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌細胞786-0購自上海中國科學院細胞庫；華蟾素購自美國Invitrogen公司，RPMI 1640 細胞培養液、10%胎牛血清購自杭州四季青公司；單克隆抗體Wnt購自美國cell signaling公司；β-catenin(ab32572)，E-cadherin(ab1416)，N-cadherin(ab76011)，Vimentin(ab92547)，內參GAPDH購自英國Abcam公司；流式細胞試劑盒，CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養 腎癌786-0細胞在5%CO2、37℃培養箱中，RPMI1640培養液中培養，將處于對數生長期的腎癌細胞用于實驗，華蟾素組添加華蟾素；對照組添加等量的PBS。本細胞實驗經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(倫理號：2017-KY-102)。

1.3 細胞增殖實驗 取處于對數生長期的腎癌細胞，調整濃度為5×103·mL-1，置于96孔板培養，用不同濃度的華蟾素(0、10、20、50、100、200 nmol/L)添加于腎癌細胞，分別于培養24、48、72 h后將10 μL CCK-8試劑添加各組腎癌細胞中，37℃細胞培養箱共培養1 h，多功能掃描自動閱讀儀檢測吸光度(OD)值，各組實驗重復3次。

1.4 細胞侵襲實驗 華蟾素添加于腎癌細胞48 h后，加入無血清培養基，在Transwell上室及下室分別加入濃度為5×104·mL-1的細胞懸液和含10%胎牛血清的培養液；培養48 h后，將樣本進行PBS洗滌，95%酒精固定，0.1%結晶紫染色。每組選取至少4個隨機視野計數穿出細胞觀察照相(200×)，各組實驗重復3次。

1.5 細胞劃痕實驗 華蟾素添加于腎癌細胞48 h后，將腎癌細胞移到6孔板培養，當每孔鋪滿90%細胞時，用200 μL加樣槍頭，進行劃痕損傷，每孔劃痕1次，48 h后，使用倒置顯微鏡，隨機選5個區域劃痕面進行拍照 (×100)，根據細胞間距計算遷移率。實驗至少重復3次。

1.6 流式細胞實驗 將腎癌細胞2×105·mL-1接種在6孔板中，華蟾素添加于腎癌細胞48 h后。PBS洗滌細胞2次，取100 μL細胞懸液(加入1×Binding Buffer結合緩沖液制成1×106細胞/mL的懸液)。加入AnnexinV與核酸染料各1 μL后輕輕混勻，室溫避光處放置15 min。再加入1×Binding Buffer 結合緩沖液80 μL 1 h內上機檢測細胞凋亡。胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。PBS清洗細胞，離心去除PBS，加入70%乙醇，4℃冰浴過夜。1 000 r/min×5 min，棄去固定液，PBS清洗細胞2次。用1 mL PI染液重懸細胞，4℃避光30 min，上機檢測細胞周期。重復實驗3次。

1.7 免疫蛋白印跡(Western blot)實驗 華蟾素添加于腎癌細胞48 h后，提取各組細胞總蛋白，每孔上40 μg蛋白進行SDS-PAGE后轉至PVDF膜，封閉后添加一抗(Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin濃度分別為1∶300、1∶500、1∶50、1∶5 000、1∶1 000)，4℃過夜。洗滌后加二抗室溫孵育2 h，洗滌，DAB顯色，成像，GAPDH作為內參，實驗重復3次。

2 結果

2.1 華蟾素可抑制腎癌細胞增殖 CCK-8實驗顯示，不同濃度華蟾素(0、10、20、50、100、200 nmol/L)作用于腎癌細胞24、48、72 h后，隨著濃度增加，腎癌細胞增殖率顯著下降(圖1)，呈劑量和時間依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。華蟾素劑量(10～100 nmol/L)都有抑制作用，而到了200 nmol/L，細胞增殖明顯下降，隨后的實驗使用100 nmol/L濃度的華蟾素，因為它對抑制腎癌細胞增殖最有效。

注：*與對照組比較P<0.05圖1 華蟾素對腎癌細胞增殖力的影響

2.2 華蟾素可抑制腎癌細胞侵襲 Transwell實驗結果表明，與對照組(344±35.56)個/視野細胞相比，華蟾素組(207±10.12)個/視野細胞明顯減少(P<0.05)，見圖2、表1。

2.3 華蟾素可抑制腎癌細胞遷移 細胞劃痕實驗結果表明，與對照組相比，華蟾素組腎癌細胞遷移率下降,組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3、表1。

表1 華蟾素對腎癌細胞侵襲和遷移能力的影響

2.4 華蟾素可促進腎癌細胞凋亡和阻滯細胞周期 流式細胞實驗結果提示，與對照組相比，華蟾素組腎癌細胞凋亡率增加,差異有統計學意義(P<0.05)。對照組G1、S細胞周期與華蟾素組比較差異無統計學意義(P>0.05)，G2/M細胞周期與華蟾素組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 華蟾素對腎癌細胞凋亡和細胞周期的影響

注：A：對照組；B:華蟾素組圖2 華蟾素對腎癌細胞侵襲力的影響(光鏡，×100)

注：A:流式細胞檢測各組腎癌細胞凋亡；B:流式細胞檢測各組腎癌細胞周期情況圖4 華蟾素對腎癌細胞凋亡和細胞周期的影響

2.5 華蟾素對Wnt/β-catenin和上皮間質變(EMT)的影響 與對照組相比，華蟾素組中Wnt、β-catenin蛋白表達下調 (P<0.05)，同時EMT信號通路E-cadherin蛋白表達上調(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白表達下調(P<0.05)，見圖5～6、表3。

表3 華蟾素對相關表達蛋白的影響

圖5 Western blot 檢測Wnt和β-catenin蛋白表達

3 討論

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統常見惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的3%[9]。2020年美國預計新診斷RCC患者63 920例，13 680例患者死亡[10]。早期或局限性RCC患者可通過手術獲得治愈，晚期或轉移期RCC患者預后不佳，5年總生存率(OS)<10%，明確RCC侵襲及轉移機制對于提高患者OS至關重要。

研究已證實華蟾素可抑制泌尿系腫瘤細胞如前列腺癌、膀胱癌等的增殖和侵襲，但對華蟾素對腎癌細胞的相關研究少見。與Xie等[7]研究結果相似，本研究使用不同濃度的華蟾素作用于腎癌細胞后，可抑制腎癌細胞增殖，以100 nmol/L濃度抑制效率最佳。Transwell侵襲試驗和細胞遷移證實，華蟾素可抑制腎癌細胞細胞侵襲和遷移的能力。流式細胞學實驗表明華蟾素可促進腎癌細胞凋亡，阻滯腎癌細胞周期，以上研究結果提示，華蟾素抑制腎癌細胞增殖可能與促進細胞凋亡增加有關。

Xie等[7]研究發現華蟾素可調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制腎癌細胞的增殖和侵襲，提示調控腫瘤細胞信號通路可能是治療RCC的有效策略。但腫瘤的發生及發展非常復雜，可能涉及多個信號通路。Wnt/β-catenin是由配體蛋白質Wnt和膜蛋白受體結合激發的一組多下游通道的信號通路，包括Wnt蛋白家族、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、APC、Axin、β-連環蛋白(β-catenin)等多個關鍵蛋白，該信號通路已證實與惡性腫瘤的發生，發展，轉移和不良預后有關[11-13]，該信號通路增強后可與細胞膜受體結合，并將信號傳遞給β-catenin，蓄積的β-catenin可進一步發揮調控通路下游蛋白和靶基因功能,并可影響EMT[14]。

EMT與腫瘤細胞包括腎癌細胞的侵襲和轉移密切相關[15]。腫瘤細胞發生EMT時，上皮細胞標記物如E-cadherin下調，而間質細胞標記物N-cadherin、Vimentin上調，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[16-17]。目前不清楚華蟾素抑制腎癌細胞增殖和侵襲是否與調控Wnt /β-catenin通路后、影響EMT相關蛋白表達有關。

本研究實驗結果表明，華蟾素作用于腎癌細胞后，下調Wnt /β-catenin信號通路中關鍵蛋白Wnt和β-catenin表達，上調E-cadherin表達，下調N-cadherin和Vimentin表達，逆轉EMT。本研究推測華蟾素作用腎癌細胞后，可調控Wnt /β-catenin信號通路，導致該通路重要蛋白Wnt和β-catenin表達下調后，對腎癌細胞EMT起抑制作用，從而降低腎癌細胞侵襲及遷移力，這可能是華蟾素抑制腎癌細胞遷移和侵襲的機制。

綜上所述，本研究推測華蟾素可能通過抑制腎癌細胞中的Wnt /β-catenin信號通路中重要蛋白Wnt、β-catenin表達后，逆轉EMT，表現為E-cadherin上調，N-cadherin、Vimentin表達下調，進而抑制腎癌細胞增殖和侵襲，提示華蟾素有可能成為治療RCC的新策略。但腎癌細胞的侵襲力及EMT的調控可能涉及多個信號通路及上游信號分子，因此仍需要進一步研究明確華蟾素調控腎癌細胞侵襲及EMT的具體機制。