慢性阻塞性肺疾病合并非小細(xì)胞肺癌與EML4-ALK融合基因的關(guān)系*

彭洋,李莎莎,王婷

天津市職業(yè)病防治院 1中西醫(yī)結(jié)合科，2綜合內(nèi)科(天津 300011)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是臨床常見的一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，在我國城市人口十大死因中排位第4，在農(nóng)村排位第1[1]。同時我國肺癌發(fā)病率、病死率均居所有惡性腫瘤首位，其中80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]。大量研究表明，COPD是肺癌發(fā)生的危險因素，盡管COPD向肺癌轉(zhuǎn)化的機制尚不明確，但據(jù)調(diào)查研究顯示，肺癌在COPD人群中發(fā)病率是正常人群的2～5倍[3]。目前研究推測兩種疾病合并存在可能與吸煙、慢性炎癥、肺功能下降等多種因素有關(guān)[4-5]。因COPD患者原有早期呼吸道癥狀多，易掩蓋肺癌早期癥狀，導(dǎo)致肺癌誤診、漏診，導(dǎo)致肺癌確診時已進入中晚期[6]。棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4-間變淋巴瘤激酶(microtubule-related protein-like in echinoderms 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)融合基因是由EML4氨基酸末端蛋白和ALK酪氨酸蛋白的胞內(nèi)區(qū)組成，與細(xì)胞惡性增殖及癌變有關(guān)，在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，是NSCLC患者靶向治療的新靶點，但EML4-ALK與COPD合并NSCLC的關(guān)系尚鮮有研究[7]。因此本研究通過免疫組化檢測COPD合并NSCLC肺癌組織中EML4-ALK融合基因蛋白的表達，探究其與COPD合并NSCLC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，以期為晚期NSCLC治療提供新的治療方案。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2018年10月COPD合并NSCLC患者70例為COPD合并NSCLC組，年齡38～75歲，平均(62.19±11.65)歲，男41例，女29例，體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)為(24.05±2.32)kg/m2，有吸煙史者40例；根據(jù)組織病理學(xué)特征，鱗癌39例，腺癌31例；根據(jù)癌癥腫瘤最大徑大小分為：≥3 cm者22例，<3 cm者48例；根據(jù)FIGO TNM分期分為，Ⅰ期+Ⅱ期49例，Ⅲa期21例；根據(jù)分化程度分為高分化12例，中低分化58例；根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有轉(zhuǎn)移者25例，無轉(zhuǎn)移者45例。另選取同期收治的單純COPD患者70例為COPD組，年齡39～75歲，平均(61.43±12.35)歲，男39例，女31例，BMI(23.41±2.15)kg/m2，有吸煙史者40例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。采集手術(shù)治療中肺癌組織及正常肺組織標(biāo)本，石蠟包埋處理后保存待檢。收集患者臨床檢查資料，本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)通過，患者及家屬知情同意并簽字。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合NSCLC[8]和(或)COPD[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均經(jīng)胸片、肺功能、細(xì)針肺穿刺細(xì)胞學(xué)、痰細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)診斷確診；(3)臨床資料完整；(4)自愿配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)妊娠期婦女或精神障礙無自主生活能力者；(3)合并肺栓塞或哮喘患者；(4)合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能障礙者；(5)合并其他傳染性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測肺組織中EML4-ALK融合基因蛋白表達 采用免疫組化法檢測肺癌及正常肺組織中EML4-ALK融合基因蛋白的水平。石蠟組織切塊以4 μm厚度連續(xù)切片后置于60℃烤箱60 min，于預(yù)熱二甲苯溶液中浸泡10 min，重復(fù)3次；梯度乙醇浸泡脫水，3%雙氧水室溫避光滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，枸櫞酸鈉抗原高壓修復(fù)5 min，添加Anti-EML4-ALK鼠源單克隆抗體(貨號：26242，NewEastbio，購自武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司)，4℃ 孵育過夜，依次添加生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗IgG(貨號：B-2752，美國Invitrogen)和DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 陽性結(jié)果判定 細(xì)胞質(zhì)(膜)或核內(nèi)呈黃色或棕色顆粒為陽性染色，采用免疫反應(yīng)積分(immune reactive score，IRS)法進行評分：染色強度(staining intensity，SI)積分，無著色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)；陽性染色細(xì)胞百分比(percentage of positive staining cells，PP)積分，陰性為0分，1%≤PP≤10%為1分，11%≤PP≤50%為2分，51%≤PP≤75%為3分，76%≤PP≤100%為4分。IRS =SI×PP，IRS≥3為陽性，IRS<3為陰性。由2名資深病理科醫(yī)師采用雙盲法隨機選取5個視野分別對染色結(jié)果進行半定量評分，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 肺功能指標(biāo)檢測 采用日本光電1550P型超聲心電圖檢測肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure，PASP)；檢測患者1 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)，計算FEV1/FVC。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 與單純COPD組比較，COPD合并NSCLC組患者PASP水平較高，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC水平較低(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者PASP、FEV1及FEV1/FVC比較

2.2 兩組患者肺組織中EML4-ALK蛋白表達情況比較 EML4-ALK蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色深染。與單純COPD組比較，COPD合并NSCLC組患者肺癌組織中EML4-ALK蛋白陽性表達率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 兩組患者肺組織中EML4-ALK蛋白表達情況比較 例(%)

2.3 EML4-ALK蛋白表達與COPD合并NSCLC患者的臨床病理特征的關(guān)系 EML4-ALK蛋白表達與COPD合并NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤最大徑、分化程度無關(guān)(P>0.05)，與吸煙史、組織學(xué)類型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 EML4-ALK蛋白表達與COPD合并NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 logistic回歸分析影響COPD合并NSCLC發(fā)生的危險因素 本研究將年齡、性別、BMI、吸煙史、FEV1/FVC、COPD、EML4-ALK蛋白表達納入自變量，以COPD合并NSCLC患者發(fā)生為因變量，進行多因素logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EV1/FVC指標(biāo)降低、吸煙、EML4-ALK蛋白陽性表達是影響COPD合并NSCLC患者發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 logistic回歸分析影響COPD合并NSCLC發(fā)生的危險因素

注：A：單純COPD組；B：COPD合并NSCLC組圖1 兩組患者肺癌組織中EML4-ALK蛋白表達情況(SP，×200)

3 討論

研究報道，吸煙史導(dǎo)致肺癌和COPD發(fā)生的共同危險因素，吸煙COPD患者發(fā)生肺癌風(fēng)險是吸煙非COPD患者的4～5倍，而COPD是肺癌圍手術(shù)期死亡和呼吸系統(tǒng)并發(fā)生的主要預(yù)測分子[10]。FEV1降低的吸煙者比FEV1正常的吸煙者發(fā)生肺癌的概率增加[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純COPD患者比較，COPD合并NSCLC患者吸煙人數(shù)比例、PASP水平較高，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC水平較低，提示COPD合并NSCLC患者存在肺功能較單純COPD患者更低的現(xiàn)象，COPD合并NSCLC發(fā)生可能與吸煙史及肺功能下降有關(guān)。然而對于嚴(yán)重COPD合并NSCLC患者，目前臨床水平不能達到根治性治療，因此探究其可能分子機制及相關(guān)臨床病理特征可能對靶向治療有一定指導(dǎo)意義。

EML4-ALK融合基因最早由Soda等于2007年在NSCLC患者術(shù)后標(biāo)本中檢出，EML4和ALK均位于2號染色體，兩者反向間隔12個堿基，EML4-ALK經(jīng)染色體倒位產(chǎn)生。EML4胞外螺旋結(jié)構(gòu)可將EML4-ALK分子激酶區(qū)形成穩(wěn)定二聚體，可活化下游PI3K-AKT、MAPK、JAK-ATAT3等多種信號通絡(luò)，與細(xì)胞惡性增殖及癌變密切相關(guān)[11-13]。隨著對EML4-ALK融合基因的研究深入發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK融合基因是NSCLC繼表皮生長因子受體(epidermal growth factor recepto，EGFR)基因突變之后被發(fā)現(xiàn)的又一突變基因，且對NSCLC針對基因檢測精準(zhǔn)靶向治療有重要決策及指導(dǎo)意義[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，晚期肺腺癌、腺鱗癌是EML4-ALK基因表達的主要人群，我國NSCLC患者中EML4-ALK基因陽性率約11.6%。王夢等[12]研究報道，EML4-ALK蛋白在NSCLC患者肺癌組織中陽性表達率顯著高于癌旁組織，且與性別、吸煙史、病理類型及臨床分期有關(guān)。吳菡等[16]研究報道，EML4-ALK融合基因在女性、60歲以下非吸煙NSCLC腺癌人群中陽性表達率較高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純COPD患者比較，COPD合并NSCLC患者肺癌組織中EML4-ALK蛋白陽性表達率高達11.43%，提示EML4-ALK蛋白陽性表達可能與COPD合并NSCLC發(fā)生發(fā)展及疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。

有研究顯示，亞裔、女性、不吸煙的肺腺癌患者是EML4-ALK主要突變對象[7]。楊文麗等[17]研究報道，在NSCLC腺癌患者中，EML4-ALK融合蛋白陽性率在性別、年齡、吸煙史、分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而在腺癌的組織類型和腫瘤大小方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD合并NSCLC患者肺癌組織中EML4-ALK蛋白陽性表達與患者吸煙史、組織學(xué)類型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、性別、腫瘤最大徑、分化程度無關(guān)，與上述研究不完全一致，推測原因可能與樣本量選擇及樣本選擇范圍不同、腫瘤異質(zhì)性或檢測方法不同等有關(guān)，提示EML4-ALK融合蛋白在COPD合并NSCLC發(fā)展過程中發(fā)揮顯著作用，但具體作用機制有待進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EV1/FVC指標(biāo)降低、吸煙、EML4-ALK蛋白陽性表達是影響COPD合并NSCLC患者發(fā)生的危險因素，提示吸煙、肺功能降低、EML4-ALK融合基因陽性突變可能增加COPD合并NSCLC發(fā)生風(fēng)險，檢測EML4-ALK融合基因可能對COPD合并NSCLC靶向治療方案制定有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究首次初步探究發(fā)現(xiàn)COPD合并NSCLC患者肺癌組織中EML4-ALK蛋白陽性表達率高，與患者吸煙史、組織學(xué)類型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響COPD合并NSCLC發(fā)生的獨立危險因素，可能對COPD合并NSCLC患者臨床靶向治療及預(yù)防方案的選取提供一定參考依據(jù)。但由于本研究樣本量少，存在不足，另關(guān)于EML4-ALK融合基因調(diào)控COPD合并NSCLC具體機制及相關(guān)通路仍不清楚，后期仍需加大樣本含量、進一步深入探究。