HPLC波長切換法測定金剛藤及其制劑中落新婦苷等5種成分的含量

陳衛平，陳 夢，紀曉燕，盧光英，毛菊華，王偉影*

（1.麗水市質量檢驗檢測研究院，浙江麗水 323000；2.浙江維康藥業股份有限公司，浙江麗水 323000）

金剛藤（菝葜）為百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀的功效，用于治療小便淋濁、帶下量多、風濕痹痛、疔瘡癰腫[1]；以金剛藤獨一味藥材提取物制成的制劑金剛藤膠囊和金剛藤軟膠囊，具有清熱解毒、化濕消腫的功效，用于附件炎等婦科疾病的治療[2-3]。金剛藤藥材現行標準缺少指標性成分含量測定[1]，其獨一味制劑選用的指標性成分為薯蕷皂苷元，含量測定方法存在前處理煩瑣、干擾組分較多等缺點[2-3]。為更好地控制金剛藤及其獨一味制劑的質量，本試驗在相關質控方法研究和藥理活性研究的基礎上[4-12]，選取了落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素等5個活性、指標性成分，采用HPLC波長切換法測定其在金剛藤藥材和制劑中的含量，以期為金剛藤藥材及其獨一味制劑的質量評價和質量控制提供一種普適方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；G4212B二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）；電子天平（XPE105，瑞士梅特勒公司）；水浴鍋（KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（DIRECT 8/16，美國密理博公司）。

1.2 試劑

落新婦苷對照品（上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：V7840010，質量分數：99.8%）；原兒茶酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110809-200604，質量分數：100.0%）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817，質量分數：96.8%）；白藜蘆醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110535-200301，質量分數：100.0%）；山柰素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-201209，質量分數：93.2%）；甲醇為色譜純（Merck）；乙腈為色譜純（Merck）；磷酸為色譜純（科密歐）；乙醇為分析純（杭州高晶精細化工有限公司）；水為自制純化水。

1.3 藥材及制劑

金剛藤藥材經麗水市食品藥品與質量技術檢驗檢測院副主任中藥師王偉影鑒定，為百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根莖。金剛藤藥材及獨一味制劑均為市場購入（詳見表1）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫為30℃；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，乙腈10%→15%；10～20 min，乙腈15%→25%；20～28 min，乙腈25%→30%；28～35 min，乙腈30%→40%；35～40 min，乙腈40%→50%；40～45 min，乙腈50%→70%；45～50 min，乙腈70%），流速為1.0 mL·min-1；柱溫35℃；檢測波長0～33 min為306 nm，33～50 min為365 nm；進樣量：10μL，理論板數按落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇與山柰素計均不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素對照品適量，分別加甲醇制成每1mL含落新婦苷543.41μg、原兒茶酸223.00μg、綠原酸573.06μg、白藜蘆醇218.60μg和山柰素201.00μg的溶液，作為儲備液。精密吸取5種儲備液置同一量瓶中，加甲醇制成每1mL分別含落新婦苷54.341μg、原兒茶酸22.300μg、綠原酸57.306μg、白藜蘆醇21.860μg和山柰素10.553μg的混合溶液，作為混合對照品溶液（已按各自質量分數折算）。

2.3 供試品溶液的制備

金剛藤供試品溶液的制備：稱取樣品粉末（過三號篩）2.0 g，精密稱定，加入70%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，取出放冷至室溫，以70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

金剛藤制劑的制備：稱取樣品內容物2.0 g，精密稱定，加入70%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，取出放冷至室溫，以70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.4 系統適用性試驗

分別精密吸取“2.2、2.3”項下溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1。在該色譜條件下，落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素與其他成分均可達到基線分離，理論塔板數均在8000以上，分離效果較好。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 線性關系、檢出限和定量限考察

精密吸取混合對照品溶液1、2、5、8、10μL，分別進樣測定，按2.1項下色譜條件進行測定，以峰面積（Y）對進樣質量（X，ng）進行線性回歸；以信噪比為3時的質量為檢出限，信噪比為10時的質量為定量限，結果詳見表2。

表2 化合物的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限

2.6 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素峰面積的RSD分別為0.77%、1.62%、0.65%、0.83%、1.55%，結果顯示儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取金剛藤軟膠囊，平行取樣6份，照“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，按干燥品計算供試品中落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素的含量分別為0.250 mg·g-1、0.196 mg·g-1、1.296 mg·g-1、0.101 mg·g-1、0.029 mg·g-1，RSD分別為1.13%、1.26%、0.89%、1.06%、1.32%。

2.8 穩定性試驗

取“2.3”項下供試品溶液，分別在0、6、12、18、24、36 h進樣，結果落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素峰面積的RSD分別為1.19%、1.35%、0.97%、1.08%、1.46%，表明供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的金剛藤軟膠囊6份，各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素對照品儲備液溶液1.0 mL、1.8 mL、4.5 mL、1.0 mL、0.3 mL及70%乙醇91.4 mL，按“2.3”項下方法制備回收率試液，按“2.1”色譜條件測定，測定落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素的含量，計算得回收率分別為100.02%、99.01%、100.16%、100.26%、99.56%，RSD分別為1.57%、1.06%、1.292%、1.12%、1.67%。

2.10 樣品含量測定結果

取各樣品約2.0 g，各3份，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 金剛藤及其制劑中各成分的含量測定結果（mg·g-1，n=3）

3 討論

在參考相關研究的基礎上[8-12]，考察了甲醇-水和乙腈-水兩個系統，結果以乙腈-水系統加入少量磷酸分離效果較理想且峰形較佳、分析時間短。本文在預實驗時選用4波長（260 nm、290 nm、330 nm和365 nm）同時測定5種成分，結合190～400 nm波段紫外掃描的結果，確定306 nm作為落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸和白藜蘆醇的檢測波長，365 nm作為山柰素的檢測波長，并選擇33 min為波長切換點，檢測波長由306 nm變成365 nm，使落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素可以在同一色譜條件下測定，且色譜峰可以在同一色譜圖中呈現。此法不僅適用于DAD檢測器、雙波長紫外檢測器，也適用于普通的單波長紫外檢測器，具有普適性、便捷等優點，可為金剛藤及其獨一味制劑質量評價提供方法參考。

測定結果顯示：不同產地和不同企業的金剛藤獨一味制劑中5種成分含量差異較大；綠原酸為其中最穩定、含量優勢明顯的成分；山柰素在3個金剛藤藥材中均不能檢出，在2個獨一味制劑中均有檢出，含量差別近4倍；落新婦苷、原兒茶酸和白藜蘆醇在不同產地的金剛藤中差別較大，在兩個獨一味制劑中差別亦較大。各成分差異大，初步判斷可能與產地、采收時間有關，項目組在后續研究中將針對金剛藤產地和采收時間進行研究。鑒于化合物的特征性和藥效活性，結合相關研究[8-12]，建議將落新婦苷、白藜蘆醇和綠原酸3種成分作為金剛藤及其獨一味質量評價的指標成分。