硝苯地平對大鼠牙齦退縮的治療研究

姜春慧，陳永吉，李孝迪，紀(jì) 悅，胡佳敏，楊如會

（麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江麗水 323000）

牙齦退縮，指牙齦緣向釉牙骨質(zhì)界的根方退縮導(dǎo)致的牙根暴露，多為牙周炎的伴發(fā)病變，其主要病理改變?yōu)檠例l組織中膠原纖維的減少、膠原排列稀疏、黏附性降低等，嚴(yán)重的牙齦退縮可伴發(fā)牙槽骨的吸收[1]。牙齦退縮是導(dǎo)致食物嵌塞、牙齒松動和脫落等口腔疾病的重要原因[2]。牙齦退縮目前尚缺乏特效治療方法，尋找有效的治療牙齦退縮的防治藥物對改善口腔衛(wèi)生具有重要意義。

硝苯地平（Nifedipine,Nif）是預(yù)防和治療冠心病、心絞痛的常用藥物，藥物性牙齦增生是硝苯地平特有的不良反應(yīng)之一[3]。目前認(rèn)為Nif能夠誘導(dǎo)牙齦角質(zhì)細(xì)胞生長因子及其受體誘導(dǎo)膠原合成，促進(jìn)牙齦組織Wnt1和β-catenin的基因和蛋白表達(dá)[4]；并通過干擾細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動降低整合素α2β1結(jié)合力，從而降低整合素介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的吞噬膠原的功能[5]。Nif通過上述作用增加牙齦膠原的產(chǎn)生并減少膠原的降解。上述研究表明，Nif對牙齦組織的作用，提示Nif可能具有增加退縮牙齦細(xì)胞修復(fù)增殖能力及改善牙齦退縮的作用。本研究擬通過動物模型試驗驗證該假說，為開發(fā)防治牙齦萎縮的藥物做研究基礎(chǔ)，并對牙齦退縮的機(jī)制做探討。

1 材料與方法

1.1 材料

Nif平標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所，批號：100338）；脂多糖（LPS,Sigma，L2630）；成年SD大鼠40只，體重220±20g，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005；病理HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，D006-1-1）；Masson染色試劑盒（Solarbio，G1345）；TGF-β1一抗（abcam，ab190503）、Keratin 5（Krt5）一抗（abcam，ab64081）；離心柱形RNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司，GK3016）；RT SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物公司，貨號R222-01）；定量PCR試劑盒（南京諾唯贊生物公司，Q411-02）；Micro-CT（Genoray，Papaya 3D Plus）；游標(biāo)卡尺（晶思達(dá)，JSD-KC）；定量PCR儀（BIO-RAD，CFX Connect Real-Time System）；顯微鏡（OLYMPUS，BX43）。

1.2 Nif水凝膠的制備

分別把Nif標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所，批號：100338）100 mg和50 mg分別溶于50 mL2%羧甲基纖維素鈉溶液中，磁轉(zhuǎn)子攪拌2 h，分別制備成1 mg/mL和2 mg/mL濃度的Nif水凝膠，4℃冷藏儲備。

1.3 動物分組

針對牙齦退縮的主要原因，設(shè)計大鼠牙齦退縮模型。按體重隨機(jī)分為4組，分別為空白對照組（Control）、模型組（Model）、模型+Nif高劑量（2 mg/mL）組、模型+Nif低劑量組（1 mg/mL）。每組8～10只，屏障動物實驗室喂養(yǎng)，溫度22℃～26℃，相對濕度60%～80%，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.4 牙齦退縮模型復(fù)制方法

參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，采用改良手術(shù)方法復(fù)制大鼠牙齦退縮模型：SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉6 mL/kg麻醉。大鼠被固定于手術(shù)板上，使其面部朝上，固定四肢，大鼠開口器分開上下頜，暴露上頜磨牙區(qū)，碘伏對上頜磨牙及近中黏膜區(qū)進(jìn)行表面消毒，沿著大鼠上頜第一磨牙近中端部位用刀片割開3 mm左右，暴露上頜近中牙齦，并剝離牙齦組織，手持牙科低速手機(jī)，以400～500 r/min的轉(zhuǎn)速用慢速球鉆在上頜第一磨牙近中端的牙齦下組織制備骨缺損（4 mm×2 mm×2 mm）。傷口用醫(yī)用縫合線小心縫合，縫合后進(jìn)行表面消毒。實驗完畢后，將大鼠放置于實驗室的鼠籠中，定期觀察大鼠，正常飲食。大鼠牙齦傷口可在術(shù)后數(shù)天內(nèi)痊愈，同時每天用棉簽在患處涂1 mg/mL的LPS溶液1次，手術(shù)完成15 d后觀察大鼠牙齦退縮改變，明確牙齦退縮模型成功。

1.5 藥物干預(yù)方法

經(jīng)病理驗證模型成功后，按組別設(shè)計分別進(jìn)行藥物干預(yù)：大鼠頭部固定后，用開口器固定口腔，用修剪的兒童牙刷把凝膠反復(fù)涂抹患處，持續(xù)1 min，每日早晚2次，持續(xù)18 d，對照組和模型組用凝膠輔料進(jìn)行干預(yù)。

1.6 牙齦退縮測量

每3 d用游標(biāo)卡尺測量1次牙齦退縮變化，并觀察牙齦黏膜損傷后愈合情況。

1.7 Micro-CT掃描組織

18 d末，將大鼠麻醉后，用Micro-CT進(jìn)行口腔牙齦掃描，掃描精度15μm，掃描結(jié)束后對大鼠牙齦組織進(jìn)行測量分析。

1.8 病理HE染色和Masson染色

大鼠麻醉處死后，取部分大鼠牙齦組織浸入10%EDTA溶液中脫鈣，每3 d更換1次溶液，3周后梯度酒精脫水、石蠟包埋切片，4μm切片，按試劑盒說明書進(jìn)行HE和Masson染色，觀察牙齦組織、黏膜、牙槽骨等病理改變。

1.9 牙齦組織TGF-β1、Krt5免疫組化染色

采用過氧化物酶標(biāo)記的免疫組化法分別行TGF-β1、Krt5染色。免疫組化評分：染色結(jié)果采用半定量分析方法，以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細(xì)胞百分比：0%～5%評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，＞75%均評為4分。最終評分為陽性細(xì)胞百分比得分與染色強(qiáng)度得分的和：0分為陰性，3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強(qiáng)陽性[8]。

1.10 Real-Time PCR檢測TGF-β1、Krt5基因表達(dá)

取部分牙齦組織，使用Trizol試劑（Invitrogen,U.S.A）提取總RNA。使用MMLV-reverse transcriptase（Fermentas，CAN）將其轉(zhuǎn)化為cDNA。用TGF-β1、Krt5引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過將閾值周期（Ct）值歸一化，使用計算公式2-ΔΔCt計算出每個樣本中TGF-β1、Krt5的相對mRNA量?；蛞铮篢GF-β1 Sense primer：5’-CACCATCCATGACATGAACC-3’，Anti-sense primer：5’-TCATGTTGGACAAC TGCTC-3’；Krt5 Sense primer:5’-AGGGCACCAAGACCATAAAGCA-3’，Anti-sense primer：5’-TTCATGTAGGCCGCGTCCAC-3’；GAPDH Sense primer：5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3’，Anti-sense:primer:5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。

1.11 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以mean±S.D.表示，差異性分析采用t檢驗或χ2檢驗，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 Nif改善大鼠牙齦退縮

模型復(fù)制15 d后，Nif干預(yù)組分別用1 mg/mL和2 mg/mL濃度的Nif凝膠每天兩次干預(yù)牙齦退縮區(qū)域，18 d后，結(jié)果顯示，模型組牙齦退縮明顯，牙根裸露，而Nif干預(yù)組牙齦退縮明顯減輕（圖1.A，箭頭所示）。測量結(jié)果顯示：1 mg/mL自干預(yù)6 d起，2 mg/mL自干預(yù)3 d起顯示明顯的治療效果（與模型組對比，P＜0.01）（圖1.B）。

圖1 不同濃度的Nif對大鼠退縮程度的干預(yù)作用

2.2 Nif可以增加牙齦退縮模型組織含量

為研究牙齦退縮模型組織缺損的改變，采用Micro-CT檢測組織形態(tài)改變。結(jié)果顯示，模型組顯示組織明顯缺損（1.86±0.34 mm2），而1 mg/mL Nif（1.09±0.29 mm2）和2 mg/mL Nif（0.64±0.38 mm2）每天2次干預(yù)，18 d可以明顯增加牙齦組織含量，與模型組對比，牙齦組織明顯增加（P＜0.01）（圖2）。

圖2 Micro-CT分析大鼠牙齦組織缺損

2.3 Nif可以恢復(fù)退縮牙齦組織形態(tài)

為進(jìn)一步分析Nif干預(yù)后牙齦退縮模型病理改變，用HE染色和Masson染色分析病理和膠原變化。HE染色結(jié)果顯示，與空白對照組對比，模型組上皮組織結(jié)構(gòu)分層不清晰，表皮層和真皮層明顯變薄，顆粒層和棘層不明顯，皮下結(jié)締組織排列紊亂，組織厚度不足。Nif干預(yù)后可以明顯增加上皮角化層、顆粒層和棘層。2 mg/mL Nif組顯示其牙齦組織基本恢復(fù)正常。Masson染色結(jié)果顯示，對照組牙齦組織膠原纖維密集，排列整齊，纖維較長。模型組真皮組織纖維組織排列紊亂，表皮組織纖維缺乏。Nif干預(yù)后可以改善纖維排列，增加纖維含量，增加的纖維以表皮層組織為主（圖3）。

圖3 HE和Masson染色分析大鼠牙齦組織病理改變

2.4 Nif可以增加牙齦組織TGF-β1、Krt5的蛋白和基因表達(dá)

為進(jìn)一步分析牙齦組織膠原纖維類型變化，通過免疫組化檢測TGF-β1、Krt5的蛋白改變，用RT-PCR檢測其mRNA改變。免疫結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組缺損的牙齦上皮的角化層、顆粒層和棘層變薄，其TGF-β1、Krt5的蛋白表達(dá)較低。而Nif干預(yù)組的牙齦上皮角化層、顆粒層和棘層明顯增厚，蛋白表達(dá)明顯增加。而真皮層和皮下組織表達(dá)量差別不大。RT-PCR結(jié)果顯示，模型組TGF-β1、Krt5的mRNA表達(dá)降低，而Nif干預(yù)組可以增加mRNA的表達(dá)（圖4）。

圖4 通過免疫組化和Real-Time PCR檢測大鼠牙齦組織TGF-β1和Krt5的蛋白和基因改變

3 討論

牙齦退縮的原因比較復(fù)雜，如物理損傷、慢性牙周炎、年齡因素等[9]。本課題通過物理方法復(fù)制牙齦組織缺損，加LPS模擬炎癥刺激，成功復(fù)制了大鼠牙齦退縮模型。本研究初步證實了Nif對大鼠牙齦退縮模型的治療作用。

牙齦組織變薄和牙槽骨吸收是導(dǎo)致牙齦退縮的根本因素[10]。本研究中，與模型組對比，Nif可以增加牙齦組織含量，恢復(fù)缺損的牙齦組織，2 mg/mL Nif干預(yù)組牙齦形態(tài)基本恢復(fù)正常。說明Nif可以恢復(fù)退縮的牙齦組織。作為經(jīng)典的鈣通道組織，Nif能夠升高牙齦上皮細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高可能是鈣離子拮抗劑誘導(dǎo)牙齦增生的機(jī)制[11]。本研究中，Nif明顯增加纖維組織含量，恢復(fù)牙齦上皮正常結(jié)構(gòu)，尤其對牙齦上皮的顆粒層和棘層比較明顯。顆粒層和棘層是上皮中比較活躍的細(xì)胞層，通過分裂增殖修復(fù)損傷的牙齦上皮或組織，是維持牙齦正常形態(tài)和功能的主要細(xì)胞層[12]。本研究的結(jié)果提示，Nif對退縮模型的治療作用主要是通過恢復(fù)牙齦上皮顆粒層和棘層的活性來實現(xiàn)的。

TGF-β1可由多種細(xì)胞分泌，在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，在組織生長、修復(fù)及細(xì)胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，TGF-β1在牙齦退縮的病理改變中也具有重要作用，通過TGF-β1可促進(jìn)靶細(xì)胞增殖及膠原纖維的合成[13-14]。為進(jìn)一步研究Nif對牙齦退縮的作用機(jī)制，我們檢測了TGF-β1的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)，結(jié)果顯示，Nif可增加牙齦上皮細(xì)胞顆粒層和棘層細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)。說明Nif增加上皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)是促進(jìn)牙齦組織修復(fù)的重要因素。

角化層對牙齦上皮具有保護(hù)作用，牙齦上皮細(xì)胞的正常角化也是其功能的重要表現(xiàn)[15]。細(xì)胞角蛋白是一組僅見于上皮細(xì)胞的中間絲成分,它們又能分為8種Ⅱ型（Krt 1～8）和12種Ⅰ型（Krt 9～20）角蛋白，Krt5是牙齦表皮角蛋白的一種，也是上皮細(xì)胞分裂能力和成熟的重要標(biāo)志[16-17]。通過PCR和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Nif可以增加Krt5的表達(dá)，其主要分布在上皮細(xì)胞的角化層、顆粒層和棘層，說明Nif有可以促進(jìn)牙齦上皮修復(fù)和成熟的功能。

本研究初步顯示，采用Nif持續(xù)進(jìn)行局部干預(yù)，可以有效增加退縮的牙齦上皮細(xì)胞，恢復(fù)牙齦組織正常結(jié)構(gòu)，該作用與促進(jìn)上皮組織表皮細(xì)胞的分裂和增殖、促進(jìn)上皮細(xì)胞角化成熟有關(guān)。提示Nif局部應(yīng)用可以成為有效治療牙齦退縮的候選藥物。