脲酶驅動不同晶型碳酸鈣微納米顆粒的制備

周惠，田志鋒，唐小微，修志龍

（1大連理工大學生物工程學院，遼寧大連 116024；2大連理工大學土木工程學院，遼寧大連 116024）

引 言

碳酸鈣（CaCO3）的微納米顆粒具備尺寸小、比表面積大、高空隙率等優良特性，不僅作為填充材料廣泛應用于涂料、塑料、油墨、造紙等領域[1-5]，而且因其良好的生物相容性和無毒性而用作催化劑載體、藥物輸送載體、功能材料模板、生物傳感器等，在食品工業[6-7]、生物醫學[8-10]、環境工業[11-13]等領域有潛在的應用前景，因此碳酸鈣微納米顆粒的制備成為當前學者們研究的熱點課題。CaCO3晶體可分為方解石、文石和球霰石三種不同的結晶形態，分屬三方、正交和立方晶系，其中球霰石的熱力學性質最不穩定，在一定條件下易轉化為方解石或文石，所以要想獲得亞穩定的球霰石具有一定的挑戰性。

制備微納米CaCO3的方法有機械粉碎法、石灰乳通CO2法、可溶性碳酸鹽和鈣鹽反應法以及微生物誘導沉淀法（microbially induced precipitation,MIP）。機械粉碎法是通過機械壓力加工粉碎獲得CaCO3粉末，但是這種方法難以獲得粒徑較小的CaCO3。石灰乳通CO2法與可溶性碳酸鹽和鈣鹽反應法均可獲得粒徑較小的CaCO3，但是獲得的CaCO3顆粒分散性較差，晶型難以調控。MIP法主要應用于巖土工程領域，如地基加固、裂縫修復等[14]。已有研究結果顯示，MIP法形成的CaCO3晶型主要有方解石和球霰石，粒徑在10~50μm之間[15-16]。

用可溶性碳酸鹽和鈣鹽反應法制備微納米CaCO3時，影響CaCO3晶型、外形和尺寸的主要因素包括溫度、pH、反應物濃度、添加劑種類等。通過改變反應溫度可以合成不同晶型的CaCO3，溫度為2~3℃時可合成菱形方解石，25℃時合成球形球霰石，40℃時合成星形球霰石[17]。反應體系中的碳酸根與鈣離子反應會使溶液pH升高。隨著pH的升高CaCO3晶型會發生變化，如pH=8.0時，球霰石是CaCO3的主要晶型；而pH=13時，方解石是CaCO3的主要晶型[18]。反應物濃度對CaCO3沉淀也有一定的影響，如溫度為30℃時，2 mmol/L的等濃度Na2CO3和CaCl2反應可獲得空心球霰石；當二者濃度增加至5.0 mmol/L，則可獲得純度較高的方解石聚集體；繼續增大濃度至12.5 mmol/L，獲得納米球霰石組成的實心球形CaCO3[19]。此方法為了獲得不同的CaCO3晶體，通常需要額外在反應體系中加入氨基酸[20-21]、蛋白質[22-23]、可溶性淀粉[19]、聚合物[24]、表面活性劑[6,25-26]等添加劑。

MIP法是利用微生物生長代謝過程中產生的CO32-，在堿性條件下與Ca2+反應形成CaCO3沉淀。菌體種類、培養基組分或代謝物的組成等都會對晶體形態產生重要的影響。如用不同的細菌物種可以從同一合成培養基中誘導生成不同數量、形狀和類型的碳酸鹽晶體[27]。目前，脲酶分解尿素形成CaCO3沉淀是應用最廣泛的MIP方法之一[28]。脲酶催化尿素水解為1分子氨和1分子氨基甲酸[式(1)]，氨基甲酸自發水解成氨和碳酸[式(2)]，氨和碳酸在水中進一步離解平衡，分別形成NH4+、OH-和HCO3-、H+[式(3)和式(4)]。OH-導致pH增加，從而形成CO32-[式(5)]與溶液中Ca2+反應形成CaCO3[式(6)]，反應方程式如下：

其中，S.pasteurii作為產脲酶能力較強的細菌被廣泛研究，多數研究認為S.pasteurii細胞表面帶有負電荷，可以提供成核位點，可在細胞表面形成穩定和連續的CaCO3沉淀[29]。但是，活菌液和滅活菌液誘導生成的CaCO3晶型不同，活菌條件下得到直徑大于10μm的球型CaCO3，在S.pasteurii細胞表面的微環境中有納米級的碳酸鈣形成，而滅活菌液中得到的CaCO3晶體為典型的方解石[30]。單細胞水平MIP研究顯示，細胞與沉淀物共存時產生方解石和球霰石沉淀物[31]。更有研究顯示MIP過程中晶體形成分為三個階段，初始階段為無定形碳酸鈣和球霰石沉淀，第二階段是方解石成核以及第一階段晶體的溶解，最后階段主要是方解石的生長[32]。方解石種子的存在使得形成的方解石晶體更具有不規則形狀[33]。此外，不同的鈣源對CaCO3晶體的影響更為復雜，如氯化鈣誘導的CaCO3多為穩定的方解石，乙酸鈣多為片層狀的球霰石，乳酸鈣和葡萄糖酸鈣則為更復雜的堆積狀球霰石[34]。

有關細菌誘導CaCO3多晶型沉淀的研究不少，但是利用脲酶水解尿素制備微納米CaCO3的研究鮮有報道，無細胞的脲酶溶液誘導CaCO3沉淀也難以用細胞成核的觀點解釋。本研究利用S.pasteurii細胞生長代謝的產物制備不同形式的脲酶溶液，考察CaCO3晶型和尺寸的影響因素，為制備空心球霰石微納米CaCO3提供了一種新的方法。

1 實驗材料和方法

1.1 微生物和試劑

菌種：S.pasteuriiBNCC136654，購自北京北納創聯生物公司。

試劑：酪蛋白胨、大豆蛋白胨、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G250、氯化鈉、尿素、無水氯化鈣、氫氧化鈉、瓊脂粉、鹽酸、Tris，以上試劑無特殊說明均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物的培養 將含15 g/L酪蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化鈉的培養基在121℃高溫條件下滅菌15 min，20 g/L尿素采用過膜滅菌。接種量為1%，溫度為30℃，轉速200 r/min，在發酵罐中培養24 h。

平板活菌計數法：將OD600=4的菌液，稀釋成不同梯度1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，分別取不同稀釋菌液100μl用無菌涂布棒均勻涂在固體培養基中，每個稀釋梯度涂3個平板，30℃培養24 h，選擇合適的稀釋倍數進行計數。

1.2.2 不同脲酶處理液 以細菌濃度OD600=4為標準，取體積相同的發酵液（fermentation broth），離心后得上清液脲酶溶液（supernatant）；同時將菌體重懸于pH相同的Tris-HCl緩沖液中，得到菌體溶液（bacterial cell）；粗酶溶液（crude enzyme solution）是通過細胞破碎獲得的，將裝有菌體懸浮液的50 ml離心管置于冰中，在超聲破碎儀中進行破碎（300 W，超聲4 s，間隔4 s，超聲15 min），超聲結束后，12000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

1.2.3 CaCO3沉淀的制備 在20℃條件下，將一定濃度和體積的尿素溶液與富含脲酶的溶液先反應30 min，之后在1200 r/min條件下邊攪拌邊加入同等濃度和體積的氯化鈣溶液，反應一定時間后取樣，離心（12000 r/min，5 min)后用純凈水洗滌2次，去掉CaCO3表面大部分的菌體和細胞分泌物，自然干燥后進行晶體測定及成分分析。

1.2.4 脲酶活性的測定 取1 ml菌液與9 ml 1.1 mol/L的尿素溶液混合，在30℃、pH=9的條件下反應，用電導率儀測量5 min內溶液的電導率變化，將電導率的平均變化值按式（7）計算脲酶單位時間內水解尿素的能力（mmol/(L·min)），即可表示為單位脲酶活性（U/L）。如果脲酶活性較高，可以稀釋后測量[35]。

1.2.5 蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量，取0.2 ml的待測溶液于試管中，加緩沖液至1 ml，再加入4 ml的考馬斯亮藍G-250溶液，靜止10 min后，在595 nm波長下測量吸光度，再與標準曲線對比得出蛋白質含量[36]。牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白。

1.2.6 掃描電鏡（SEM）分析 采用鎢燈絲和場發射掃描電鏡對制備好的微納米CaCO3的形貌進行觀察分析，取少量CaCO3樣品置于導電膠帶上，用氮吹儀吹去表面多余樣品，對其進行噴金處理后測試樣品，加速電壓為20 kV，分辨率為3.0。用ImageJ軟件對CaCO3顆粒的大小進行分析，每個樣品組取3張不同圖像，每幅圖像測量50個不同顆粒[18]。

1.2.7 X射線衍射儀（XRD）分析X射線用Cu Kα源產生，發射電流75 mA，電壓為12 kV，掃描范圍為2θ=3°~80°，掃描速度為10(°)/min，步長0.01°，將1~3 mg的樣品放入儀器進行測試。

根據以下公式計算不同體系中方解石和球霰石的摩爾分數[25]：

1.2.8 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析 將少量CaCO3粉末與KBr顆粒混合充分研磨，之后在4000~500 cm-1波數范圍內以0.2 cm/s的速度收集光譜。

2 結果與討論

2.1 不同脲酶催化體系中脲酶活性和反應過程中pH的變化

細菌濃度OD600=4時，平板活菌計數法得到細胞數為1.3×108CFU/ml。對不同脲酶催化體系中的脲酶活性和蛋白濃度進行測定，計算出脲酶的比活性，結果如表1所示。在發酵液中，脲酶比活性較低，為(4.06±0.12)U/g；而在細胞破碎后獲得的粗酶液中，脲酶比活性較高，為(6.63±0.21)U/g。這是因為脲酶是一種胞內酶，細胞破碎后會釋放較多的脲酶到環境中。上清液和菌體溶液中脲酶比活性分別為(4.28±0.12)U/g和(6.05±0.01)U/g。

表1 不同溶液的脲酶活性測定結果Table 1 The results of urease activity in different solutions

對不同體系脲酶催化制備碳酸鈣（加入氯化鈣后）過程中30 min內pH的變化進行監測，結果如圖1所示。在加入氯化鈣的瞬間，溶液中的碳酸根與鈣離子迅速反應，pH快速降低。發酵液和上清液催化反應的pH變化范圍接近，在8.09~8.36之間；菌體和粗酶溶液催化反應的pH變化范圍在8.41~8.65之間。pH的變化主要是由溶液中離子的變化引起的，菌體和粗脲酶溶液中的脲酶比活性較高，相同時間內水解尿素產生的NH4+、HCO3-、OH-較多，所以導致反應過程中pH偏高。

圖1 不同脲酶溶液催化反應30 min內的pH變化Fig.1 pH changes within 30 min during reaction catalyzed by urease in different solutions

2.2 不同脲酶溶液對CaCO3形貌和尺寸的影響

不同脲酶體系催化制備的CaCO3掃描電鏡圖（圖2）顯示，不同催化體系可以得到不同晶型的CaCO3顆粒，包括球形、方形和橢圓形。發酵液脲酶催化獲得大小不均一的球形CaCO3[圖2（a）]，粒徑均值為(3.32±0.87)μm[圖2（c）]；上清液脲酶催化獲得粒徑較為均一的球形CaCO3[圖2（b）]，粒徑均值為(1.36±0.27)μm[圖2（d）]。菌體脲酶催化獲得的CaCO3外貌表現為大小不一的立方體[圖2（e）]，而粗酶液催化獲得的CaCO3外貌有橢圓形和球形[圖2（f）]。CO2-3的含量會影響碳酸鈣的成核生長[37]，脲酶水解尿素產生的CO2-3在不同時間濃度不同，與Ca2+反應成核生長時間不同，造成碳酸鈣粒徑大小不均一。

圖2 不同脲酶溶液催化獲得CaCO3沉淀的SEM圖像和粒徑分布Fig.2 SEM images and particle size distribution of CaCO3 precipitates prepared by urease in different solutions

進一步用XRD表征不同催化體系中形成的CaCO3晶型。XRD中球霰石的特征峰在21.004°、24.972°、27.124°、32.861°、43.945°、50.269°，對應于（004）、（110）、（112）、（114）、（300）、（118）晶面。方解石的特征峰在23.016°、29.406°、35.925°、39.381°、47.075°，對應于（012）、（104）、（110）、（113）、（024）晶面。從圖3的XRD圖中發現，發酵液和粗酶液催化獲得的CaCO3中既有方解石，又有球霰石，而上清液催化獲得的CaCO3為純球霰石，菌體催化獲得的CaCO3晶型主要為方解石。

圖3 不同脲酶溶液催化獲得CaCO3沉淀的XRD圖像（Bacterial cells/Crude enzyme solution/Fermentation broth/Supernatant分別代表菌體/粗酶液/發酵液/上清液Fig.3 XRD images of CaCO3 precipitation obtained by urease in different solutions

不同脲酶體系催化獲得的球霰石和方解石比例如表2所示，發酵液催化獲得的球霰石占比為88.10%，方解石占比為11.90%；上清液催化獲得的CaCO3均為球霰石，占比為100.00%；菌體催化獲得的方解石占比為100.00%；粗酶液催化獲得的球霰石占比為53.26%，方解石占比為46.74%。

表2 不同脲酶溶液中球霰石和方解石的占比Table 2 Proportion of vaterite and calcite by urease in different solutions

用場發射掃描電鏡對上清液催化獲得的純球霰石進一步觀察，發現微米級球霰石表面是由粒徑更小的納米球霰石組成的[圖4（a）]，這些納米球霰石的平均粒徑為(25.12±4.76)nm[圖4(d)]。微米級球霰石表面為有縫隙的多孔結構[圖4（b）]；同時也發現由納米級球霰石組成的微米級球霰石內部是一種中空結構[圖4（c）]。這與Wei等[19]以淀粉為模板，在碳酸鈉和氯化鈣的濃度為2 mmol/L時形成的球霰石結構類似。細胞的某些分泌物可能具有與淀粉類似的模板作用。此外，在粗酶液催化獲得的CaCO3中，發現橢圓形CaCO3表面同樣由納米球霰石組成[圖4（e）]，但尚不清楚其內部結構；在粗酶液和發酵液催化獲得的CaCO3中觀察到的球體包括由球形 和 層 狀CaCO3構 成 的 球 體[圖4（f）、（g）]。S.pasteurii培養基中含有豐富的蛋白質，在賦形劑對CaCO3晶體轉化的影響研究中發現添加酪蛋白會增加球霰石含量，其次是方解石[25]。研究顯示Ca2+濃度在0.5 mol/L時不會抑制脲酶活性，且S.pasteurii水解尿素速率的提高可誘導足夠量的方解石沉淀[38]。

圖4 球霰石和粗脲酶溶液催化獲得CaCO3晶體的形態Fig.4 Morphology of vaterite and CaCO3crystal prepared by crude enzyme solution

對不同脲酶體系催化制備的CaCO3進行紅外光譜分析，結果如圖5所示，方解石的特征吸收峰為1421、1082、876、713 cm-1，分別對應C—O反對稱伸縮振動、C—O對稱伸縮振動、O—C—O面外變形振動和O—C—O的面內變形振動。球霰石的特征吸收峰為1421、1082、870、750 cm-1，分別對應C—O反對稱伸縮振動、C—O對稱伸縮振動、O—C—O面外變形振動和O—C—O的面內變形振動。明顯觀察到粗酶液催化獲得的CaCO3晶體在1140 cm-1處含有羥基的一個強特征峰，可能是細胞內富含帶有羥基的物質。在CaCO3成核過程中，羥基對CaCO3形態的影響可以用自組裝分子外部順序的不確定性來解釋[39]。羥基自由地圍繞Cn-X鍵旋轉，但是由于氫鍵的作用，使得圍繞C鍵的羥基表面的外部順序是固定的，所以CaCO3成核朝兩個相反的方向進行，形成橢圓型CaCO3[40]。

圖5 不同脲酶溶液催化形成的CaCO3晶體紅外譜圖Fig.5 Infrared spectra of CaCO3 precipitates

2.3 脲酶活性和反應物濃度對球霰石的影響

脲酶活性不僅影響尿素的水解速率，而且脲酶作為一種蛋白質對CaCO3晶體也有一定的影響。在溫度為20℃，轉速為1200 r/min，反應物（尿素和氯化鈣）濃度為0.5 mol/L條件下，用活性分別為2、4、8、16 mmol/(L·min)的脲酶液催化制備CaCO3，分別在反應時間<1 min內和30 min時取樣觀察，結果如圖6所示。隨著脲酶活性的增強，CaCO3形態越來越規則，呈現為球形，而且在反應1 min內獲得的CaCO3形態明顯比30 min后形態更加規則，說明脲酶活性高有利于球形球霰石晶體的形成。較低的脲酶活性可能不足以支撐CaCO3成核后保持球體的形態。

圖6 脲酶活性對球霰石的影響[(a)~(d)的反應時間<1 min;(e)~(h)的反應時間是30 min]Fig.6 Effect of urease activity on vaterite urease activity/(mmol/(L·min)):(a),(e)2;(b),(f)4;(c),(g)8;(d),(h)16

球霰石的粒徑與反應物濃度有關，濃度越大，粒徑越大。為了獲得粒徑更小的球霰石，探索了反應物濃度對粒徑的影響。在溫度為20℃、轉速為1200 r/min、脲酶活性為8 mmol/(L·min)時，反應物（尿素和氯化鈣）濃度設為0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L情況下制備球霰石，分別在反應時間<1 min內和30 min時取樣觀察，結果如圖7和圖8所示。在不同反應物濃度中，極短時間（<1 min）內形成的球霰石粒徑較大，30 min時球霰石粒徑較小。說明CaCO3發生了二次成核，可能是CaCO3的自組裝或溶解和再沉淀所致[41-42]。反應時間<1 min時，隨著反應物濃度的增大，球霰石粒徑減小。反應物濃度為0.05 mol/L時，球霰石平均粒徑為(11.21±1.63)μm；反應物濃度為0.5 mol/L時，球霰石平均粒徑為(2.9±0.42)μm。而在30 min時，隨著反應物濃度的增大，球霰石粒徑的變化較小，均在1μm左右。

圖7 反應物濃度對球霰石的影響[(a)~(d)的反應時間<1 min;(e)~(h)的反應時間是30 min]Fig.7 Effect of reactant concentration on vaterite reactant concentration:(a),(e)0.05 mol/L;(b),(f)0.1 mol/L;(c),(g)0.3 mol/L;(d),(h)0.5 mol/L

圖8 不同反應物濃度和時間對球霰石平均粒徑的影響Fig.8 Average particle size of vaterite under different reactant concentrations at<1 min and 30 min

2.4 球霰石穩定性的探究

球霰石是一種亞穩態晶體，并且比CaCO3其他晶型具有更高的溶解度。在水溶液中，亞穩態的球霰石很容易在3 min內通過溶解再結晶的方式向方解石轉化[9]。為了延長球霰石的存在時間，獲得較穩定的球霰石，往往通過加入添加劑來實現。事實證明，無論是有機添加劑還是無機添加劑，都會對晶體的生長速率起重要作用，并且可以抑制球霰石轉變為方解石[43]。

以0.5 mol/L碳酸鈉和0.5 mol/L氯化鈣化學反應作為對照組，對脲酶溶液催化獲得的純球霰石穩定性進行探究。結果發現在水溶液中，對照組在極短時間（<1 min）內獲得的CaCO3有方形和球形兩種形態[圖9（a）]，而在30 min時獲得的CaCO3只有方形[圖9（b）]，在第7天和第14天獲得的CaCO3為方形聚集體[圖9（c）、（d）]。脲酶催化制備的純球霰石組中，在極短時間（<1 min）和30 min時獲得的CaCO3只有球形[圖9（e）、（f）]，直到第7天才觀察到球形CaCO3的變形體，出現菱形CaCO3[圖9(g)]，到第14天時球霰石全部變為方形的聚集體[圖9（h）]。

XRD圖顯示了對照組和球霰石組在不同時間的存在狀態（圖10），從上到下的XRD譜圖分別代表圖9（a）~（h）的CaCO3晶體。在對照組中，極短時間（<1 min）內存在少量球霰石，大部分是方解石；30 min時球霰石特征峰消失，顯示均為方解石；第7天和第14天均為方解石特征峰。純球霰石組中，極短時間（<1 min）內和30 min時，均為球霰石特征峰，無方解石特征峰存在；在第7天出現方解石特征峰，證明球霰石轉變為方解石；第14天球霰石的特征峰消失，溶液中均為方解石。表3顯示了對照組和純球霰石組不同時間方解石和球霰石的含量。

表3 對照組和純球霰石組在不同時間球霰石和方解石的占比Table 3 Proportion of vaterite and calcite in control group and pure vaterite group at different time

圖9 方解石和球霰石在不同時間的SEM圖(a)~(d)分別是對照組在<1 min、30 min、7 d、14 d時的晶體形態;(e)~(h)分別是純球霰石組在<1 min、30 min、7 d、14 d時的晶體形態Fig.9 SEM of calcite and vaterite at different time(a)—(d)were the crystal morphology of the control group at<1 min,30 min,7 d and 14 d,respectively;(e)—(h)were the crystal morphology of the pure vaterite group at<1 min,30 min,7 d and 14 d,respectively

圖10 對照組和純球霰石組在不同時間的XRD譜圖(a)對照組,<1 min;(b)對照組,30 min;(c)對照組,7 d;(d)對照組,14 d;(e)球霰石組,<1 min;(f)球霰石組,30 min;(g)球霰石組,7 d;(h)球霰石組,14 dFig.10 XRD of control group and pure vaterite group at different time(a)control group,<1 min;(b)control group,30 min;(c)control group,7 d;(d)control group,14 d;(e)vaterite group,<1 min;(f)vaterite group,30 min;(g)vaterite group,7 d;(h)vaterite group,14 d

有研究提出CaCO3結晶的過程是由無定形CaCO3轉化為球霰石再轉化為方解石[44]。通過對球霰石穩定性的探究，未觀察到球霰石之前的CaCO3存在形態，脲酶催化獲得的純球霰石在水溶液中存在較長時間可能是細胞代謝產物延長了球霰石向方解石轉變的時間。

3 結 論

不同脲酶溶液催化獲得的CaCO3晶體具有不同的形態。上清液和菌體酶液催化獲得的CaCO3分別為純球霰石和純方解石；發酵液催化獲得球霰石含量較多，方解石含量較少；粗酶液催化獲得球霰石和方解石含量約為1∶1。脲酶催化獲得的微米級球霰石是由納米球霰石組成，且納米球霰石之間存在孔隙。在反應物濃度為0.5 mol/L時，脲酶活性越高越有利于球霰石的形成。脲酶活性為8 mmol/(L·min)時，極短時間（<1 min）內球霰石粒徑隨著反應物濃度增大而減小；30 min時不同反應物濃度獲得的球霰石的粒徑均為1μm左右。與化學法（碳酸鈉和氯化鈣反應）獲得的CaCO3相比較，脲酶催化獲得的純球霰石在水溶液中可保存較長時間（7 d），有利于藥物載體的開發利用。

球霰石在藥物載體中有巨大的應用潛力。脲酶催化可獲得由納米級球霰石組成的多孔微米球霰石，比化學法制備的球霰石更有潛力，但相比磁性復合球霰石[45]的可控性要差，具有磁性的物質（如Fe3O4和α-Fe2O3）可通過外部磁場控制，實現磁性復合球霰石的定向移動，而本實驗中脲酶催化獲得的球霰石中不含磁性物質，缺乏這種定向操控。可以借鑒硫酸鐵和氨水反應制備磁性α-Fe2O3納米顆粒[46]加以改進，因為尿素酶解會產生氨水，這部分工作將在后續研究報告中進一步探討。