GidA調控豬鏈球菌氨基酸代謝譜的分析

高婷 袁芳艷 劉澤文 劉威 周丹娜 楊克禮 郭銳 梁婉 陳文杰 田永祥

摘要：為比較豬鏈球菌中gidA缺失菌株與野生菌株氨基酸代謝之間的差異，揭示GidA調控氨基酸代謝的規律，為豬鏈球菌致病性的解析以及防控提供理論依據，分別收集gidA缺失菌株、野生菌株菌體，采用高效液相色譜法（HPLC）、質譜儀在正離子模式下進行質譜分析，檢測樣本中30種氨基酸及其衍生物的含量，比較gidA缺失菌株、野生菌株菌體中氨基酸代謝譜的差異。結果表明，2種菌株中精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐及鳥氨酸具有顯著差異（P<0.05，倍數差異>1.2），其中精氨酸上調約4倍，天冬酰胺下調約17倍。說明tRNA修飾酶GidA缺失引起豬鏈球菌氨基酸代謝異常，尤其是精氨酸與天冬酰胺，其機制可能與豬鏈球菌致病性下降相關。

關鍵詞：豬鏈球菌;tRNA修飾酶;GidA;氨基酸代謝

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2021）07-0010-03

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人獸共患傳染病病原菌，不僅感染豬還感染人，嚴重時導致敗血癥型休克甚至死亡，給養豬業造成重大的經濟損失，也威脅著人類的身體健康和生命安全[1-3]。tRNA修飾酶葡萄糖抑制分裂蛋白A（Glucose inhibited division protein A，GidA）是全局性的調控因子，對細菌的生長以及致病性具有重要的調控作用[4]，然而GidA蛋白對豬鏈球菌的氨基酸代謝譜的影響尚未見文獻報道。本研究利用多反應監測技術，以標準品為參照，對特定氨基酸代謝物群進行有針對性、特異性的檢測與分析，發現GidA對豬鏈球菌的氨基酸代謝譜產生了嚴重的擾動，尤其是精氨酸，而精氨酸代謝又與豬鏈球菌致病性相關。毒力因子ADS 是精氨酸代謝的重要途徑，廣泛存在于原核生物體內。ADS主要由精氨酸脫亞氨ArcA、ArcB 和ArcC 3種核心酶組成，通過上述核心酶的作用最終將精氨酸催化降解生成鳥氨酸、二氧化碳、氨和ATP，為細菌提供能量以及增強細菌對酸性環境的適應性。因此，本研究為豬鏈球菌致病性的解析以及防控提供了新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

試驗儀器：5500 QTRAP質譜儀（AB SCIEX），Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統，低溫高速離心機（Eppendorf 5430R），色譜柱Zic-HILIC 3.5 ?m，2.1 mm×150 mm Column。

試劑：甲酸（Fluka，06450），乙腈（Merck，1499230-935），甲醇（Merck，144282），所有氨基酸及其衍生物的標準品均購自Sigma-Aldrich。

1.2 代謝物提取

取細菌菌體樣本，每個樣本中加入1 mL 預冷甲醇/乙腈/水（2∶2∶1，V/V/V），轉移至1.5 mL離心管中，渦旋混合，冰浴中超聲30 min，-20 ℃孵育1 h用于沉淀蛋白，14 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清，真空干燥。質譜檢測時加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）復溶，14 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清進樣分析。每組另取樣本適量，等量混合為質控（Quality control，QC）樣本。QC樣本按照上述方法平行進行制備。

1.3 高效液相色譜條件

樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統進行分離。流動相：A液為含0.08% FA 25 mmol/L甲酸銨水溶液，B液為0.1% FA乙腈。樣品置于4 ℃自動進樣器中，柱溫40 ℃，流速為250 μL/min，進樣量2 μL。相關液相梯度如下：0～12 min，B液從 90%線性變化到70%;12～18 min，B液從70%線性變化到50%;18～25 min，B液從50%線性變化到40%，30.0～30.1 min，B液從40%線性變化到90%;30.1～37.0 min，B液維持在90%。樣本隊列中每間隔一定數量的樣本設置一個 QC 樣本，用于檢測和評價系統的穩定性及重復性。

1.4 質譜分析

采用5500 QTRAP 質譜儀（AB SCIEX）在正離子模式下進行質譜分析。5500 QTRAP ESI 源條件如下：Source temperature 500 ℃，Ion source gas1（Gas1）：40，Ion source gas2（Gas2）：40，Curtain gas（CUR）：30，Ion sapary voltage floating（ISVF）5500 V;采用多反應監測模式檢測待測離子對。

1.5 數據處理

采用Multiquant軟件提取色譜峰面積及保留時間。采用氨基酸及其衍生物的標準品矯正保留時間，進行代謝物鑒定。

2 結果與分析

2.1 △gidA缺失菌株與野生菌株SC19氨基酸及其衍生物多反應監測結果

樣本中共檢測到23種氨基酸及其衍生物，以△gidA與SC19定量比較，其中精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐以及鳥氨酸具有顯著差異（P<0.05，倍數差異>1.2），其中精氨酸上調約4倍，天冬酰胺下調約17倍，詳細定量數據見表1。

2.2 氨基酸代謝組聚類分析

為了評價候選氨基酸的合理性，同時更全面直觀地顯示樣本之間的關系以及氨基酸在不同樣本中的表達模式差異，利用定性的顯著性差異氨基酸的表達量對各組樣本進行層次聚類分析，結果見圖1。由圖1可見，精氨酸上調顯著，天冬酰胺下調顯著（紅色代表顯著性上調氨基酸，藍色代表顯著性下調氨基酸）。

2.3 系統穩定性評價

所有樣品等量混合制備成為QC樣本，采用QC樣本對實驗過程儀器系統的穩定性和重復性進行評價。結果見圖2。由圖2可見，檢測氨基酸及其衍生物在QC樣本中相對標準偏差小于30%，說明實驗過程儀器系統穩定、數據可靠。

3 小結與討論

氨基酸對于維持細菌正常的生理功能至關重要，氨基酸代謝的異常對細菌的適應性、耐藥性及致病性影響重大[5]。細菌在宿主體內對酸性環境的耐受性與存活、定殖、感染、組織炎癥反應密切相關，而精氨酸代謝途徑通過產生氨來增強細菌對酸性環境的適應性，并且已有文獻證實精氨酸代謝途徑與細菌的致病性有關[6-8]。Khoury 等[9]研究發現，在補充谷氨酰胺以后，肺炎鏈球菌在青霉素作用下的存活率提高，表明谷氨酰胺降低了細菌對青霉素的敏感性。豬鏈球菌是一種人畜共患病原菌，根據莢膜多糖的差異，可分為33個血清型，其中2型是毒力最強的優勢血清型[10]，然而豬鏈球菌2型的氨基酸代謝研究尚未見有人涉及。本研究采用靶向氨基酸代謝組學技術，分析了tRNA修飾酶GidA對豬鏈球菌氨基酸代謝譜的影響，篩選到精氨酸、天冬酰胺等顯著改變的氨基酸，揭示了GidA調控氨基酸代謝的規律，為豬鏈球菌致病性的解析以及防控提供了理論依據。

參考文獻：

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