武漢市馬源腸球菌的耐藥性分析

摘要：腸球菌（Enterococci）作為條件性致病菌廣泛存在于人和動物中，其耐藥性和致病性隨地區和動物來源的不同而變化。據現有數據顯示，關于武漢市馬源腸球菌的耐藥性研究相當匱乏。以武漢市2個馬術俱樂部42匹溫血馬為主要研究對象，分別對馬匹糞便進行樣品搜集并進行耐藥研究（氨芐西林，四環素，慶大霉素，頭孢氨芐，恩諾沙星，氯霉素，諾氟沙星，紅霉素，萬古霉素、林可霉素等）。結果顯示，從42份樣本中分離出10株糞腸球菌，分離率為23.8%;藥敏試驗結果顯示，分離株中有6株為慶大霉素耐藥，6株為頭孢類抗生素耐藥，2株為慶大霉素和頭孢類抗生素混合耐藥，其他藥物未產生耐藥性。結果表明該俱樂部馬源腸球菌已對慶大霉素和頭孢類抗生素產生嚴重耐藥性，試驗為該馬術俱樂部用藥提供了理論依據。

關鍵詞：馬源腸球菌（Enterococcus）;耐藥性;武漢市

中圖分類號：S852.61+1? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2021）07-0017-03

腸球菌（Enterococcus）為觸媒陰性、單個或鏈狀排列的格蘭氏陽性球菌，是人及動物微生物群中正常存在的一部分，一般不會引起發病，屬于條件性致病菌[1，2]。有學者報道，腸球菌屬菌種有19個，主要有鳥腸球菌（E. avium）、病臭腸球菌（E. malodoratus）、棉子糖腸球菌（E. raffinosus）、糞腸球菌（E. faecalis）、屎腸球菌（E. faecium）、鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）、蒙氏腸球菌（E. mundtii）、殊異腸球菌（E. dispar）、盲腸腸球菌（E. cecorum）和孤立四聯球菌（E. Solitarius）等，至2003年確定的腸球菌屬已增至31種[3]。在正常人群中，堅忍腸球菌（E. durans）和海氏腸球菌（E. Hirae）攜帶率分別為18%和9%。而在家畜中，堅忍腸球菌主要存在于牛及仔雞中。腸球菌的分布隨地區不同而不同，在西班牙臨床上主要的腸球菌種為糞腸球菌與屎腸球菌，而在瑞典等國家主要為屎腸球菌和海氏腸球菌。腸球菌一直被認為是非致病性陽性菌存在，臨床風險很小，但近年來很多研究發現腸球菌是導致外科傷口、血液、泌尿道、腦膜和血管感染的主要醫院病原體[4]，目前，由腸球菌引起的菌血癥及心內膜炎已在醫院廣泛存在，其中糞腸球菌是主要病原體，其次是屎腸球菌，而其他腸球菌種很少見發病。

腸球菌細胞壁較厚，故對多種藥物具有天然耐藥性，但也更易被誘導產生新的耐藥性。近年來，由于抗生素在臨床上的廣泛使用，腸球菌耐藥菌株不斷增多。至今萬古霉素的耐藥菌株已廣泛存在，某些抗生素甚至達到完全耐藥，且有研究表明，腸球菌攜帶的耐藥基因可在人和動物之間進行傳播，給臨床治療帶來了很大難題，對動物及人類健康造成了嚴重威脅。然而，根據武漢馬術協會數據顯示，歷年來武漢馬術俱樂部及相關工作人員的數量呈現逐年遞增的趨勢，這無疑增加了人畜共患病原體的傳播風險。由于武漢市馬源腸球菌的耐藥性調查數據極其缺乏，鑒于此，本研究對武漢馬術俱樂部進行隨機抽查，對其腸球菌分離和耐藥情況進行調查，旨在為當地馬匹疾病的防治提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以武漢市2個馬術俱樂部為主要研究對象，分別對42匹溫血馬匹進行糞便樣品采集，于-20 ℃保存。采樣時認真記錄編號，并調查俱樂部飼養管理、既往病史、役用及用藥情況。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸球菌的分離及初步鑒定 腸球菌的初步分離按照鏈球菌培養方式進行。樣品做預處理后，置于含20%兔血清的營養肉湯中進行培養，過夜后蘸取菌液接種于TSA培養基中，24 h后觀察菌落形態。表面扁平、光滑并呈灰白色菌落初步定為可疑菌落，并對可疑菌落進行格蘭式染色（陽性球菌）、觸酶試驗（陰性者為腸球菌）、16 sDNA基因擴增等進行鑒定。

1.2.2 腸球菌耐藥性研究 對“1.2.1”中的菌株進行KB紙片擴散試驗，結果根據CLSI《美國臨床實驗室標準化協會》標準進行判定。

2 結果與分析

2.1 分離鑒定結果與分析

對2個馬術俱樂部共計42份樣本分離出的10個菌株樣品分別進行革蘭氏染色（圖1）、生化試驗（表1）和觸酶試驗鑒定，結果初步鑒定為糞腸球菌，分離率為23.8%。

對初步鑒定為腸球菌菌株再次進行16sDNA PCR擴增（圖2），進一步確定為腸球菌。對16s DNA擴增引物測序并進行Blast對比分析，結果見圖3。由圖3可見，H8樣本與糞腸球菌同源性最高。

2.2 耐藥性試驗結果

將所有分離菌株進行KB紙片擴散試驗，結果顯示10株腸球菌菌株中有6株為慶大霉素耐藥（60%），6株為頭孢類抗生素耐藥（60%），2株為慶大霉素和頭孢類抗生素混合耐藥（20%），且據馬主陳述，采樣之前3個月內均未使用抗生素進行治療。具體結果見表2和圖4。

3 小結與討論

腸球菌是革蘭氏陽性兼性厭氧菌。曾被認為是非致病性共生體，臨床風險很小。最近調查顯示，腸球菌是引起人類醫院感染的第二大革蘭氏陽性細菌，是導致手術傷口、尿路、腦膜和心內膜感染的主要醫源病原體[5]。腸球菌對低至高水平的幾種抗菌素本能具有耐藥性，包括內酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷類和林可亞胺[6]。醫院感染率的增加可部分歸因于人類醫院大量使用抗菌素和腸球菌耐藥（AR）菌株的發展[7]。然而，馬源腸球菌研究相當匱乏[8]。

本試驗結果顯示，武漢市2個馬術俱樂部糞腸球菌分離率為23.8%，與韓國賽馬管理局統計數據和其他動物如藏豬分離率相比均較低[9]，這可能與本試驗采樣點局限性有關。

本試驗結果說明2個馬術俱樂部馬源腸球菌耐藥率較高，其中慶大霉素和頭孢氨芐耐藥率均達到60%，而混合耐藥率為20%（慶大霉素和頭孢氨芐）。本次試驗結果耐藥率較高，雖可能跟樣本數量有關，但仍需引起注意。本次試驗結果耐藥性與藏豬源腸球菌耐藥結果相似[9]，但與韓國馬源耐藥率（70.6%）相比較低，與葡萄牙部分地區馬源腸球菌耐藥性相比則較高（8.8%）[10，11]。

綜上所述，這是首次對武漢市馬術俱樂部腸球菌進行采樣耐藥研究。結果顯示，腸球菌優勢種為糞腸球菌，且耐藥性較為嚴重。通過韓國研究者報道顯示，耐藥性腸球菌在馬之間或馬與其環境之間可以傳播，這意味著從馬傳播到人類尤其是成為騎手、馬工等馬業工作者的潛在風險。因此，筆者后期將繼續研究武漢市馬源腸球菌與周圍環境之間的關系。

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