固相萃取偶聯液相色譜質譜聯用法測定鹿血中睪丸酮的含量

胡春蘭 陳媛媛 王春民 任貴奇▲

1.頸復康藥業集團有限公司，河北承德 067000；2.河北省中藥新輔料技術創新中心，河北承德 067000

鹿血系鹿科動物梅花鹿（Cervus nippon）和馬鹿（Cervus elaphus）的血液，具有養血益精、行血祛瘀、消腫等功效。因其資源稀缺，所以“以次充好、假冒偽劣”等現象時有發生[1-5]。睪丸酮作為鹿血中的有效成分之一，具有維持肌肉強度及質量、維持骨質密度及強度、提神及提升體能等作用。通過測定鹿血中的睪丸酮含量，能在一定程度上評價鹿血的品質[6]。由于鹿血中甾體類化合物的研究比較少，作為甾體類化合物的睪丸酮分離、結構鑒定僅限于使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]。但是HPLC測靈敏度低，抗干擾能力差，易出現假陽性。液相色譜-質譜聯用法具有定性能力強，檢測限低等優點[9-12]，其能夠利用四級桿檢測器克服基質干擾，有更好的分辨率、更高的靈敏度、具有很強的定性定量能力[13-14]。有效的樣品前處理對于定性定量分析的準確性至關重要，固相萃取作為前處理方法，具有便捷、高效等優點[15-16]。本實驗采用兩步提取、兩步萃取的方法提取和凈化鹿血中的睪丸酮，旨在建立液相色譜-質譜聯用法測定睪丸酮的含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple-TOF 4600 液質聯用質譜儀（AB SCIEX）；Centrifuge 5424 離心機（Eppendorf）；12 孔固相萃取儀（CNW Technologies GmbH）；RE-5286A 旋轉蒸發儀（上海雅榮生化設備儀器有限公司）；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋儀（IKA）；0.22 μm 微孔濾膜（Sartorius Stedim Biotech GmbH）。

1.2 材料

鹿血（批號：B1501、B1502、B1503、B1504，采集自河北省承德市承德縣鹿養殖場梅花鹿，鹿血樣品符合《鹿副產品》[17]中關于鹿血的各項質量標準要求）；氮氣（工業氮，承德燕山氣體有限公司）；乙腈、提取甲醇、正己烷、乙酸乙酯（天津歐博凱化工有限公司）；液質甲醇（美國Fisher 公司）；水（屈臣氏飲用水）；睪丸酮對照品（批號：KBBCT12；CAS：58-22-0；98%北京伊諾凱科技有限公司）；SAX SPE 柱（最大上樣量：500 mg，體積：3 mL，Part No.：63404，DIKMA）；Florisil SPE 柱（最大上樣量：500 mg，體積：3 mL，Part No.：65004，DIKMA）。

2 方法與結果

2.1 HPLC 條件與質譜條件

HPLC 色譜柱：shim-Pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：20 μL；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫（0～1 min，10%A；1～6 min，10%A→90%A；6～10 min，90%A；10～10.1 min，90%A→10%A；10.1～15 min，10%A）。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃面；多重反應檢測（multiple reaction detection，MRM）；去簇電壓（de-clustering voltage，DP）為60.0 V；碰撞能（collision energy，CE）為10.0 eV。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品制備方法 取120 mL 的批號B1501 鹿血，加入80 mL 乙腈，超聲20 min（功率150 W，頻率40 kHz），離心2 min（3800 r/min，離心半徑8.4 cm），取上清液，重復提取兩次；提取液減壓濃縮至近干，加入10 mL NaCl 溶液（0.25 g/mL）。50 mL 乙酸乙酯萃取，重復萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮至近干；加5 mL 甲醇溶解，導入離心管A 中，加入5 mL 水，待過柱凈化。

SAX 固相萃取柱以2 mL 甲醇、2 mL 50%甲醇溶液依次活化平衡，離心管A 中樣品上柱，離心管A 用2 mL 50%甲醇溶液洗滌后上柱，合并濾液導入離心管B。離心管B 中樣品50℃水浴并用氮氣吹至無醇味。加3 mL 正己烷，渦旋，靜置，取上清液，重復3 次，合并萃取液至離心管C。Florisil 固相萃取柱以4 mL乙酸乙酯，4 mL 正己烷依次活化平衡，離心管C 中萃取液過柱，流速不超過2 滴/s，離心管C 用2 mL 乙酸乙酯-正己烷（10∶90，V/V）洗滌后上柱，棄洗脫液。用4 mL 乙酸乙酯-正己烷（60∶40，V/V）洗脫柱子，重復兩次。洗脫液導入離心管D，50℃水浴并用氮氣吹至干。用1 mL 50%甲醇溶解，過0.22 μm 微孔濾膜得供試品溶液。所得圖譜見圖1、2。

圖1 B1501 批鹿血樣品中睪丸酮的二級掃描色譜圖

2.2.2 對照品制備方法 取睪丸酮對照品適量，精密稱定，置1.5 mL 離心管中，加1 mL 甲醇，搖勻，作為母液，精密量取100 μL 母液，置1.5 mL 離心管中，加900 μL 甲醇，制成濃度為30.33 μg/mL 的對照品儲備液。所得圖譜見圖3、4。

圖3 睪丸酮對照品的二級掃描色譜圖

圖2 B1501 批鹿血樣品中睪丸酮質譜圖

圖4 睪丸酮對照品的質譜圖

2.3 線性關系考察

精密量取“2.2.2”項下的睪丸酮儲備液，甲醇定容，制成濃度分別為1.5165×10-4、3.033×10-4、1.5165×10-3、3.033×10-3、1.5165×10-2、3.033×10-2、1.5165×10-1、3.033×10-1μg/mL 溶液，按照“2.1”項下條件下進樣，97.06 和109.06 兩個子離子中，子離子109.06 的響應值略大，更穩定，所以選做定量子離子。計算定量子離子109.06 的峰面積。

子離子109.06 的峰面積（Y）和濃度（X）的線性關系為：Y=145 051X+2694.6，R=0.9995。

定量子離子109.06 的R 值>0.999，表明睪丸酮在1.5165×10-4～3.033×10-1μg/mL 濃度范圍內，線性關系良好。

2.4 精密度考察

取1.5165×10-1μg/mL 濃度的睪丸酮對照品在“2.1”條件下連續進樣6 次。109.06（子離子）*和97.06（子離子）峰面積的RSD值分別為4.07%、4.12%，RSD<15%，提示儀器精密度良好（*是定量子離子）。

2.5 重復性考察

按“2.2.1”項制備的供試品溶液，重復實驗6 次，按照“2.1”條件下分別進樣。109.06（子離子）*和97.06（子離子）峰面積的RSD值分別為13.71%、13.14%，RSD<15%，提示重復性良好。

2.6 穩定性考察

取120 mL 批號B1501 的鹿血，按“2.2.1”項制備供試品溶液，分別在0.5、1、2、4、6、24 h 時間按照“2.1”條件進樣。109.06（子離子）* 和97.06（子離子）峰面積的RSD值分別為7.90%、9.40%，RSD<15%，提示供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 加樣回收率考察

采用加樣回收法，精密量取120 mL 批號B1501的鹿血（109.06 子離子測得含睪丸酮濃度為3.32×10-4μg/mL，睪丸酮含量為4.0×10-2μg），加入1 mL濃度為4.033×10-2μg/mL 的睪丸酮對照品，混勻。按“2.2.1”項制備供試品溶液，進行6 次，按照“2.1”項下條件進樣，測定109.06 子離子的峰面積，分別計算子離子的平均回收率和RSD值，結果見表1。結果顯示，本研究中，以109.06 為定量子離子的睪丸酮平均加樣回收率為66.62%。由于在基質復雜、含量低于0.01%分析中，回收率標準可適當放寬，可以低于70%，符合2020 版《中華人民共和國藥典》四部[18]的標準。

表1 以109.06 為定量子離子的睪丸酮加樣回收率結果（n=6）

2.8 鹿血中睪丸酮的測定

B1501、B1502、B1503、B15044 個批次的鹿血，分別取120 mL，每批次平行實驗4 次，按“2.2.1”項制備供試品溶液，按照“2.1”項下條件進樣，計算每個批次平均睪丸酮含量及RSD值，結果見表2。結果顯示，四個批次鹿血中睪丸酮含量范圍為3.30×10-4～3.48×10-4μg/mL，RSD均<3%。

表2 四個批次鹿血中睪丸酮的含量（n=4）

3 討論

對本實驗過程中所用的提取溶劑進行了考察。最初選用甲醇萃取鹿血中的睪丸酮，結果雜質較多，后用乙腈先沉淀蛋白，再用乙酸乙酯萃取其中睪丸酮。兩步萃取不僅增加了實驗的復雜程度，還增大了實驗過程中睪丸酮樣品的損失，降低了加樣回收率。但是大大降低檢測時雜質的影響，增加了實驗檢測數據的準確性。

對本實驗過程中所用固相萃取柱的考察。主要考察了酸性氧化鋁固相萃取柱、C18固相萃取柱、SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱。單一固相萃取柱不能降低基質效應，于是選用兩種固相萃取柱聯用法。通過文獻得出[19-21]，酸性氧化鋁固相萃取柱、C18固相萃取柱和SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱兩種萃取柱組合方法。都能降低基質效應的前提下，采用回收率法優選兩種萃取柱組合，SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱組合優于酸性氧化鋁固相萃取柱、C18固相萃取柱組合。

對本實驗過程中所用的色譜溶劑進行了考察。從甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水兩種色譜溶劑組合中優選，通過多次實驗結果得出,甲醇-0.1%甲酸水色譜溶劑結果更穩定，得出的峰型相對更好。

對本實驗質譜條件中的DP 和CE 值進行了優選。采用動態掃描優選DP 和CE 值。隨著DP 和CE值的增大，子離子量增大，母離子量減小。選取子離子和母離子量合適時的DP 和CE 值。

睪丸酮作為鹿血改善性功能的主要有效成分[22]，測定其含量能評價鹿血的質量。單一檢測鹿血中睪丸酮含量作為鹿血的質量評價條件，不能全面評價鹿血的質量，如果加入指紋圖譜法能更全面的評價鹿血的優劣，這是本課題的下一步研究。

本實驗通過固相萃取偶聯液相色譜質譜聯用法法測定鹿血中睪丸酮的含量，經方法學研究結果表明，該方法重復性好，穩定性高，回收率達標。綜上所述，本研究建立方法的結果可靠，有效降低了基質效應，能夠為更好地控制鹿血質量提供參考。